Modelos de invasão das células tumorais em três dimensões da matriz extracelular melhor refletir a In vivo Situação do que os ensaios bidimensionais motilidade. Usando ensaios matriz invasão combinada com imagem confocal de células fluorescente-etiquetados, informações detalhadas sobre os modos de invasão e as contribuições distintas de líder contra seguintes células podem ser obtidas.
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Artigo de método
Modelagem e imagem 3-Dimensional Invasion cela coletiva
Neste artigo
Resumo
Resumo
A característica definidora de malignidade do câncer é a invasão e metástase 1. Em alguns tipos de câncer (e. g. Glioma 2), a invasão local para o tecido saudável é a principal causa de doença e morte. Para outros tipos de câncer (e. g. Pulmão, mama, etc.), É o processo de metástase, em que as células tumorais se mover de uma massa do tumor primário, colonizar locais distal e, finalmente, contribuir para a falência de órgãos, que eventualmente leva à morbidade e mortalidade 3. Estima-se que a invasão e metástases são responsáveis por 90% das mortes por câncer 4. Como resultado, tem havido grande interesse em identificar os processos moleculares e mediadores de proteína crítica de invasão e metástase para fins de diagnóstico e tratamento melhorando a 5.
Um desafio para os cientistas é o desenvolvimento de câncer de ensaios de invasão que se assemelham bastante a situação in vivo empara permitir a modelagem exata da doença 6. Bidimensional ensaios motilidade celular são apenas informativos sobre um aspecto da invasão e não levam em conta remodelação proteína de matriz extracelular (ECM), que também é um elemento crítico. Recentemente, pesquisas têm refinado a nossa compreensão de invasão das células tumorais e revelou que células individuais pode mover-se por modos alongadas ou arredondadas 7. Além disso, tem havido maior valorização da contribuição de invasão coletiva, na qual as células invadem em fios, chapas e aglomerados, principalmente em tumores altamente diferenciados que mantêm características epiteliais, para a propagação do câncer 8.
Nós apresentamos um método refinado 9 para examinar as contribuições de proteínas candidatas à invasão coletiva 10. Em particular, piscinas de engenharia separadas de células para expressar diferentes proteínas fluorescentes, é possível dissecar molecularmente as atividades e Proteins necessária em células líder versus aqueles exigidos nas células seguintes. O uso de RNAi fornece a ferramenta molecular para desmontar experimentalmente os processos envolvidos na invasão de células individuais, bem como em diferentes posições de invasão coletiva. Neste procedimento, as misturas de células fluorescente-etiquetados são banhados no fundo de uma inserção de Transwell previamente preenchido com Matrigel proteína ECM, então permissão para invadir "para cima" através do filtro e no Matrigel. Reconstrução de pilhas z-series imagem, obtida por imagem confocal, em representações tridimensionais permite a visualização de fios coletivamente invadindo e análise da representação das células fluorescente-etiquetadas na liderança contra seguintes posições.
Protocolo
1. Rotulagem retroviral de células com proteínas fluorescentes
- Células placa retroviral embalagem (por ex Phoenix) para fora em 0,25 x 10 6 células por poço de uma 6-bem prato em 10% soro fetal bovino (FBS) / DMEM.
- Transfecção de células com o DNA retroviral 48 horas depois células usando Effectene acordo com as instruções dos fabricantes.
- Enxágüe poços duas vezes com meio 24 horas depois, em seguida, adicione 1,5 ml de 10% FBS / DMEM por poço.
- Coletar vírus embalados em cultura de tecidos médio 48 horas mais tarde por pipetagem e transferência para 2 tubos de microcentrífuga mL.
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Discussão
Ensaios de invasão Matrigel têm sido tradicionalmente criado com células colocado sobre uma camada de proteínas da matriz extracelular com chemoattractant induzida motilidade para e através de um filtro na parte inferior. Invasão foi classificada como uma função de quantas células podem ser contadas na parte inferior do filtro. Embora praticamente há pouca diferença com o ensaio de invasão "inversa" descrita acima, há consideravelmente mais informações sobre o processo de invasão que pode ser determinada atrav.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Financiamento para esta pesquisa é do Cancer Research UK.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | |
| DMEM (Medium Modified Dulbecco Eagle) | GIBCO | 21969 | |
| Soro fetal bovino | PAA | A15-101 | |
| Estreptomicina penicilina | GIBCO | 15140 | |
| 200 mM L-Glutamina (100x) | GIBCO | 25050-032 | |
| Puromicina | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| 0,05% Tripsina EDTA | GIBCO | 25300 | |
| Polibrene | Sigma-Aldrich | AL-118 | |
| Lipofectamine Reagente 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Transwells 6,5 milímetros, 8,0 mM tamanho dos poros | Corning | 3422 | |
| Matrigel completo | BD Biosciences | 354234 | |
| Calceína AM | Invitrogen | C1430 | |
| RNase | Qiagen | 19101 | |
| Iodeto de propídio | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| Confocal microcope | Leica | SP2MP |
Referências
- Olson, M. F., Sahai, E. The actin cytoskeleton in cancer cell motility. Clin. Exp. Metastasis. 26, 273-287 (2008).
- Hoelzinger, D. B., Demuth, T., Berens, M. E. Autocrine factors that sustain glioma invasion and paracrine biology in the brain microenvironm....
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Reimpressões e permissões
