Et eksperimentelt system til Studieinformationen Mechanotransduction i føtale lungeceller
Summary
Mekaniske kræfter spiller en central rolle i lungeudvikling og lungebeskadigelse. Her beskriver vi en fremgangsmåde til isolering af gnaver føtal lunge type II epitelceller og fibroblaster, og at udsætte dem for mekanisk stimulation ved hjælp af en<em> In vitro</em> System.
Abstract
Mekaniske kræfter, der genereres i livmoderen ved gentagne vejrtrækning-lignende bevægelser og af væske udspiling er afgørende for normal lunge udvikling. En nøglekomponent i lungeudvikling er differentieringen af alveolære type II epitelceller, den væsentligste kilde til pulmonal overfladeaktivt middel. Disse celler deltager også i væske homøostase i alveolehulrummet vært forsvar, og skade reparation. Desuden kan den distale lunge parenchymceller blive direkte udsat for overdreven strækning under mekanisk ventilation efter fødslen. Imidlertid er de præcise molekylære og cellulære mekanismer, ved hvilke lungeceller afføler mekaniske stimuli til at påvirke lungeudvikling og fremme lungebeskadigelse ikke fuldstændigt forstået. Her har vi tilvejebringe en enkel og høj renhed fremgangsmåde til isolering af type II-celler og fibroblaster fra gnaver føtale lunger. Derefter beskriver vi en in vitro system, Flexcell Strain enhed til at tilvejebringe mekanisk stimulering fosterceller, som simulerer mekaniske kræfter iføtal lunge udvikling eller lungebeskadigelse. Denne eksperimentelle system giver et fremragende værktøj til at undersøge molekylære og cellulære mekanismer i føtale lungeceller udsat at strække. Anvendelse af denne fremgangsmåde, har vores laboratorium identificeret adskillige receptorer og signalering proteiner, der deltager i mechanotransduction i føtal lunge udvikling og lungebeskadigelse.
Protocol
Discussion
I dette skrift beskriver vi en fremgangsmåde til isolering af føtale type II epitelceller og fibroblaster, og at udsætte dem for mekanisk stimulation ved hjælp af Flexcell Strain Apparatus. Vi har anvendt denne teknik til at vurdere differentiering af epitelceller 1,2 og til at studere receptoren og signalveje, der aktiveres af stretch 3-9. Desuden kan denne fremgangsmåde også anvendes til at undersøge celle-responser induceret af mekanisk skade 10,11. Proceduren er baseret på sp…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Støttet af NIH tilskud HD052670.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM | Sigma | D5648 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130 | |
| Collagenase 1A | Sigma | C9891 | |
| Chicken serum | Sigma | C5405 | |
| Screen cups | Sigma | CD1-1KT | |
| Syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-25 | |
| 100 micron nylon mesh | Small Parts, INC | CMN-100-D | |
| 30 micron mesh | Small Parts, INC | CMN-30-D | |
| 15 micron mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX15 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen-1 | Collagen Biomed | PC0701 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Vitronectin | Sigma | V-0132 | |
| Elastin | Sigma | E-6402 | |
| Bioflex plate | Flexcell International | BF-3001U | Uncoated |
| Flexcell Strain Unit | Flexcell International | FX-5000 |
Referências
- Sanchez-Esteban, J., Tsai, S. W., Sang, J., Qin, J., Torday, J. S., Rubin, L. P. Effects of mechanical forces on lung-specific gene expression. Am. J. Med. Sci. 316, 200-204 (1998).
- Sanchez-Esteban, J., Cicchiello, L. A., Wang, Y., Tsai, S. W., Williams, L. K., Torday, J. S., Rubin, L. P. Mechanical stretch promotes alveolar epithelial type II cell differentiation. J. Appl. Physiol. 91, 589-595 (2001).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Gruppuso, P. A., Rubin, L. P. Mechanical stretch induces fetal type II cell differentiation via an epidermal growth factor receptor-extracellular-regulated protein kinase signaling pathway. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 30, 76-83 (2004).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Lee, N., Silbert, O., McKnight, N. L., Frangos, J. A. Strain-induced fetal type II epithelial cell differentiation is mediated via cAMP-PKA-dependent signaling pathway. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 291, L820-L827 (2006).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Filardo, E. J., Rubin, L. P., Ingber, D. E. Integrins {beta}1, {alpha}6, and {alpha}3 contribute to mechanical strain-induced differentiation of fetal lung type II epithelial cells via distinct mechanisms. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 290, L343-L350 (2006).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Soto-Reyes, D., Lee, H. S., Warburton, D., Sanchez-Esteban, J. Mechanical stretch promotes fetal type II epithelial cell differentiation via shedding of HB-EGF and TGF-alpha. J. Physiol. 587, 1739-1753 (2009).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Drouillard, D., Santos, M., Hokenson, M. A., Hawwa, R. L. A role for caveolin-1 in mechanotransduction of fetal type II epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 298, L775-L783 (2010).
- Lee, H. S., Wang, Y., Maciejewski, B. S., Esho, K., Fulton, C., Sharma, S. Interleukin-10 protects cultured fetal rat type II epithelial cells from injury induced by mechanical stretch. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 294, L225-L232 (2008).
- Hawwa, R. L., Hokenson, M. A., Wang, Y., Huang, Z., Sharma, S., Sanchez-Esteban, J. IL-10 inhibits inflammatory cytokines released by fetal mouse lung fibroblasts exposed to mechanical stretch. Pediatric Pulmonology. , (2011).
- Kitterman, J. A. The effects of mechanical forces on fetal lung growth. Clin. Perinatol. 23, 727-740 (1996).
- Harding, R., Crystal, R. G., West, J. B., Banes, P. J. Fetal breathing movements. The Lung: Scientific Fountations. , 2093-2104 (1997).
- Harding, R., Liggins, G. C. Changes in thoracic dimensions induced by breathing movements in fetal sheep. Reprod. Fertil. Dev. 8, 117-124 (1996).
