Transplante de células germinativas e Tecidos Testículo xeno em Ratos

Resumo

Protocolos para transplante de células germinativas e xeno tecidos testiculares são descritos. Germinativas resultados de células de transplante em doador-derivado espermatogênese em testículos beneficiárias, bem como representa um ensaio de reconstituição funcional para identificação de células-tronco espermatogónias (SSCS). Testículo tecido xeno reproduz o desenvolvimento dos testículos e espermatogênese de espécies doadoras diferentes em camundongos receptores.

Resumo

Gérmen de transplante de células foi desenvolvido pelo Dr. Ralph Brinster e colegas da Universidade da Pensilvânia, em 1994, ^1,2. Estes estudos inovadores mostraram que a microinjeção de células germinativas de camundongos doadores férteis no interior dos túbulos seminíferos de ratos inférteis receptor resulta em doador-derivado espermatogênese e produção de espermatozóides pelo animal destinatário ^2. O uso de machos dadores que transportem a identificação gene bacteriano β-galactosidase permitido de doador-derivado espermatogênese e transmissão de o haplótipo o dador até ao a prole, pelos animais, destinatário ^1. Surpreendentemente, após o transplante para dentro do lúmen dos túbulos seminíferos, as células germinativas transplantados eram capaz de se mover a partir do compartimento luminal para a membrana cave, onde espermatogônias estão localizados ^3. É geralmente aceite que SSCs só são capazes de colonizar o nicho e restabelecer a espermatogênese nos testículos beneficiários. Portanto células germinativas,transplante oferece uma abordagem funcional para estudar o nicho de células-tronco nos testículos e caracterizar supostas células-tronco espermatogônias. Até à data, o transplante de células de gérmen é usado para elucidar a biologia célula básica do caule, para produzir animais transgénicos através da manipulação genética de células germinais antes do transplante ^4,5, para estudar de Sertoli interação célula a célula de gérmen de ^6,7, SSC homing e colonização ^{3, 8,} bem como SSC auto-renovação e diferenciação ^9,10.

Transplante de células germinativas é também viável em grandes espécies ^11. Nestes, as principais aplicações são a preservação da fertilidade, a divulgação da genética nas populações animais de elite, e geração de animais transgênicos como o estudo da espermatogênese ea biologia SSC com esta técnica é logisticamente mais difícil e caro do que em roedores. Transplante de células germinais de espécies de grande porte no interior dos túbulos seminíferos de ratos resulta em colonizatíon de células doadoras e de expansão das espermatogónias, mas não na sua plena diferenciação presumivelmente devido à incompatibilidade do compartimento da célula destinatário somática com as células germinativas a partir de espécies filogeneticamente distantes ^12. Uma abordagem alternativa é o transplante de células germinativas a partir de espécies de grandes juntamente com o seu compartimento de somática circundante. Nós relatada pela primeira vez em 2002, de que pequenos fragmentos de tecido testículo a partir de machos imaturos transplantados sob a pele dorsal de camundongos imunodeficientes são capazes de sobreviver e submetidos a um desenvolvimento pleno com a produção de esperma fertilização competente ^13. Desde que, em seguida, tecido testículo xeno-enxerto tem sido mostrado para ser bem sucedido em muitas espécies e emergiu como uma alternativa valiosa para estudar o desenvolvimento dos testículos e espermatogênese de animais de grande porte em camundongos ^14.

Protocolo

PARTE A. transplante de células germinativas em camundongos

1. Preparação de camundongos de destinatário

1. Destinatários deve ser imunologicamente tolerante (quer seja geneticamente combinados a doadores ou imuno-deficientes) para as células testiculares dos doadores.
2. Destinatários deve ser ou naturalmente desprovido de espermatogênese (por exemplo, W / W ^v camundongos) ou empobrecido de células germinais endógenas. Depleção de células Germ pode ser alcançado por irradiação ou drogas quimioterápicas, tais como O busulfan. Neste protocolo, descrevemos o método de preparação de ratos receptores com busul....

Discussão

1. Gérmen de transplante de células

Gérmen de transplante de células fornece o ensaio somente funcional para a confirmação inequívoca de a presença de células-tronco espermatogónias (SSCs) em uma população de células. SSC só pode casa e colonizar o nicho SSC na membrana basal e iniciar doador-derivado espermatogênese. Gérmen de transplante de células tornou possível para estudar e manipular SSCs em uma forma sem precedentes. A técnica tem sido utilizada para produzir animais transgénicos atrav.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
Colagenase (tipo IV)	Sigma	C5138
Tripsina-EDTA	Invitrogen	25200-056
DNaseI	Sigma	DN25
DMEM	Invitrogen	31053-028
Trypan azul	Invitrogen	15250-061
Filtro de nylon de malha celular	BD Biosciences	352340 (40μm) 352350 (70μm)
Busulfan	Sigma	B2635
De parede fina capilares de vidro	Instrumento de precisão Mundial	TW 100-3
BD tubulação plyethylene intramedic (PE100)	BD	CA-63018-725
Ethicon fio de seda 6-0	Ethicon	706G
Grampos de sutura	BD	427631
Sigmacote	Sigma	SL2
X-gal	Sigma	B4252
Ferrocianeto de potássio	Sigma	P9387
Ferricianeto de potássio	Sigma	P3667
cloreto de magnésio	Sigma	208337
desoxicolato de sódio	Sigma	D6750
N, N-Dimetilformamida	Sigma	D4551
Igepal CA-630	Sigma	18896