Induktion Dendritic Tillväxten i Odlade sympatiska nervceller
Summary
Vi beskriver ett protokoll för användning av benmorfogenetiskt protein-7 (BMP-7) eller Matrigel att selektivt inducera dendritisk tillväxt i primära sympatiska neuroner dissocierade från ganglion cervicale superius (SCG) hos perinatal råtta.
Abstract
Formen på dendritiska bersån bestämmer den totala synaptiska mata in ett neuron kan ta emot 1-3, och påverkar de typer och fördelningen av dessa ingångar 4-6. Förändrade mönster av dendritiska tillväxt och plasticitet är förknippade med nedsatt neurodysfunktion funktion i experimentella modeller 7, och tros bidra till kliniska symptom som observerats i både nervsystemets sjukdomar 8-10 och neurodegenerativa sjukdomar 11-13. Sådana observationer understryker funktionella betydelsen av exakt reglering dendritiska morfologi, och tyder på att identifiera mekanismer som styr dendritiska tillväxten inte bara kommer att öka förståelsen för hur nervkopplingar regleras under normal utveckling, men kan också ge insikt om nya terapeutiska strategier för olika neurologiska sjukdomar.
Mekanistiska studier av dendritiska tillväxten skulle vara mycket underlättas av tillgången oFA modellsystem som gör att nervceller kan experimentellt kopplas från en stat där de inte sträcker sig dendriter till en där de utarbeta en dendritisk berså jämförbar med den av deras in vivo motsvarigheter. Primära kulturer av sympatiska neuroner dissocierade från ganglion cervicale superius (SCG) hos perinatal gnagare ger en sådan modell. Vid odling i definierat medium i frånvaro av serum och ganglion gliaceller, sympatiska neuroner sträcker sig ett enda förfarande, som är axonal, och detta unipolär tillstånd varar i veckor eller månader i odling 14,15. Emellertid utlöser tillsats av antingen benmorfogenetiskt protein-7 (BMP-7) 16,17-eller Matrigel 18 till odlingsmediet dessa neuroner sträcker sig till multipla processer som uppfyller de morfologiska, biokemiska och funktionella kriterier för dendriter. Sympatiska nervceller dissocierade från SCG av perinatala gnagare och odlas under definierade förhållanden är en homogen population av neuroner 19att reagera på samma sätt för den dendritliknande aktiviteten av Matrigel, BMP-7 och andra BMP i decapentaplegic (DPP) och 60A underfamiljer 17,18,20,21. Viktigare, inträffar Matrigel-och BMP-inducerade dendritbildning i frånvaro av förändringar i cellöverlevnad eller axonal tillväxt 17,18.
Här beskriver vi hur du ställer in dissocierade kulturer av sympatiska nervceller härrör från SCG av perinatala råttor så att de är lyhörda för den selektiva dendritliknande främja aktivitet Matrigel eller BMP.
Protocol
Discussion
Fördelarna med denna modell innefattar: (a) kulturerna består av en homogen population av sympatiska neuroner som saknar andra celltyper 17,23, (b) de tillväxtfaktorreceptorer krav sympatiska neuroner är väl etablerad, vilket medger användning av definierat medium, och en mängd olika definierade medier och substrat fungerar bra för att odla och upprätthålla sympatiska neuroner 23, (c) neuroner i dessa kulturer reagera på samma sätt för den dendritliknande aktiviteten av Matrigel, BMP-7…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av finansiering från National Institutes of Health (bidrag R21 NS45037 och R01 ES014901).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Glass coverslips | Bellco | 1943-10012 | 12 mm Round Coverslip #1 Thickness, German glass |
| Bent tip pipets | Bellco | 1273-50003 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P0899-100MG | Stock solution 1 mg/ml |
| Distilled water | Gibco | 15230 | |
| Fine forceps Dumont no. 4 and 5 | Fine Science Tools (FST) | 11252-30 11241-30 | |
| 20-gauge needles | Becton Dickinson | 305176 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Invitrogen | 11415 | |
| Collagenase | Worthington | 4176 | 1 mg/ml |
| Dispase | Roche | 04942078001 | 5 mg/ml |
| Hank’s balanced salt solution( -Ca,-Mg) | Invitrogen | 14185-052 | |
| DMEM Low glucose | Invitrogen | 11885 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 20 mM |
| Insulin/Transferrin/ Selenium | Invitrogen | 51500-056 | 100X |
| Fatty-acid free BSA | Calbiochem | 126609 | |
| NGF | Harlan Bioproducts | 5017 | |
| Ham F-12 nutrient medium (F-12) | Invitrogen | 11765 | |
| Cytosine arabinoside | Sigma | C1768 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | Avoid repeated freeze-thaw cycles |
| BMP-7 | R&D Systems Curis, Inc. | 345-BP BMP7-07H | BMPs 4, 5 and 6 work equally as well as BMP-7 and are sometimes easier to obtain commercially |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Mouse anti-rat MAP2 antibody | Sternberg Monoclonals Inc. | SMI52 | 1/5000 |
| Alexa Fluor 546 goat-anti-mouse | Invitrogen | A11003 | 1/10000 |
| Mounting media | Prolong Antifade kit Molecular Probes | P7481 |
Table 1. Materials.
Referências
- Purpura, D. P., Quarton, Q. C., Melnechuk, T., Schmitt, F. O. . The Neurosciences: A Study Program. , 372-393 (1967).
- Purves, D. Functional and structural changes in mammalian sympathetic neurons following interruption of their axons. J. Physiol. 252, 429-463 (1975).
- Purves, D. . A Trophic Theory of Neural Connections. , (1988).
- Miller, J. P., Jacobs, G. A. Relationships between neuronal structure and function. J. Exp. Biol. 112, 129-145 (1984).
- Schuman, E. M. Synapse specificity and long-term information storage. Neuron. 18, 339-342 (1997).
- Sejnowski, T. J. The year of the dendrite. Science. 275, 178-179 (1997).
- Berger-Sweeney, J., Hohmann, C. F. Behavioral consequences of abnormal cortical development: insights into developmental disabilities. Behav. Brain Res. 86, 121-142 (1997).
- Connors, S. L. Fetal mechanisms in neurodevelopmental disorders. Pediatric Neurology. 38, 163-176 (2008).
- Pardo, C. A., Eberhart, C. G. The neurobiology of autism. Brain Pathology (Zurich, Switzerland). 17, 434-447 (2007).
- Zoghbi, H. Y. Postnatal neurodevelopmental disorders: meeting at the synapse. Science. 302, 826-830 (2003).
- de Ruiter, J. P., Uylings, H. B. Morphometric and dendritic analysis of fascia dentata granule cells in human aging and senile dementia. Brain Res. 402, 217-229 (1987).
- Flood, D. G., Coleman, P. D. Hippocampal plasticity in normal aging and decreased plasticity in Alzheimer’s disease. Prog. Brain Res. 83, 435-443 (1990).
- Jagadha, V., Becker, L. E. Dendritic pathology: an overview of Golgi studies in man. Can. J. Neurol. Sci. 16, 41-50 (1989).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. I. Conditions under which neurons form axons but not dendrites. Dev. Biol. 128, 324-336 (1988).
- Tropea, M., Johnson, M. I., Higgins, D. Glial cells promote dendritic development in rat sympathetic neurons in vitro. Glia. 1, 380-392 (1988).
- Lein, P. The effects of extracellular matrix and osteogenic protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. Int. J. Dev. Neurosci. 14, 203-215 (1996).
- Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15, 597-605 (1995).
- Lein, P. J., Higgins, D. Laminin and a basement membrane extract have different effects on axonal and dendritic outgrowth from embryonic rat sympathetic neurons in vitro. 136, 330-345 (1989).
- Higgins, D., Lein, P. J., Osterhout, D. J., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , 177-295 (1991).
- Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons. BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).
- Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).
- Lein, P. J. Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists. J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).
- Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth. Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).
