Isolering af Mouse Lung dendritiske celler
Summary
En højtrenset forberedelse af musen lunge dendritiske celler er beskrevet. Særlig vægt gives til isolering af konventionelle dendritiske celler delmængde.
Abstract
Lung dendritiske celler (DC) spiller en fundamental rolle i sensing invaderende patogener 1,2 samt i kontrollen af tolerogenic svar 3 i luftvejene. Mindst tre delmængder af lunge dendritiske celler er blevet beskrevet i mus: konventionelle DC (CDC) 4, plasmacytoid DC (PDC) 5 og IFN-producerende killer DC (IKDC) 6,7. CDC delmængde er den mest fremtrædende DC delmængde i lungerne 8.
Den fælles markør kendt for at identificere DC delmængder er CD11c, en type I transmembrane integrin (β2), som også er udtrykt på monocytter, makrofager, neutrofile og nogle B-celler 9. I nogle væv, bruger CD11c som markør for at identificere musen DC gyldig, som i milten, hvor de fleste CD11c + celler repræsentere CDC delmængde, der udtrykker høje niveauer af de store histocompatibility komplekse klasse II (MHC-II). Men lungen er en mere heterogen væv, hvor derside DC delmængder, der er en høj procentdel af en særskilt cellepopulation, der udtrykker høje niveauer af CD11c anfald lave niveauer af MHC-II. Baseret på at karakterisere og for det meste på sin udtryk for F4/80, en milt makrofag markør, har CD11c hi MHC-II lo lunge cellepopulation blevet identificeret som pulmonale makrofager 10 og senere, som en potentiel DC forløber 11.
I modsætning til mus PDC, har studiet af den særlige rolle, CDC i det pulmonale immunforsvar været begrænset på grund af manglen på en specifik markør, der kunne hjælpe i isolation af disse celler. Derfor, i dette arbejde, beskriver vi en procedure for at isolere højtrenset musen lunge CDC. Isolering af pulmonale DC delmængder repræsenterer et meget nyttigt redskab til at opnå indsigt i funktionen af disse celler som reaktion på respiratoriske patogener såvel som miljømæssige faktorer, der kan udløse værtens immunrespons i lungerne.
Protocol
Discussion
Isolering af pulmonal musen DC er en vigtig teknik til studiet af en bred vifte af respiratoriske stimuli. Processen med at opnå disse celler indeholder vigtige skridt, der forhindrer tab af celler samt cellernes levedygtighed og renhed. Perfusing lungen før kollektionen vil medvirke til at fjerne enhver perifere celler samt reducere forurenende erytrocytter. Brugen af automatiserede dissociation kan advanteogus, når et stort antal lunger håndteres, ellers kan du vælge den alternative protokol holde sig for ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke for at Marilyn Dietrich på LSU Flowcytometri Core facilitet for hendes hjælp med cellesortering og Peter Mottram for hans hjælp med microphotographs. Dette arbejde blev finansieret af Flight Attendant Medical Research Institute, LSU-kompetitive forskning Program Award, og NIH / NIAID Tilskud P20 RR020159 og R03AI081171.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| ACK lysing buffer | Invitrogen | D6-0005DG | |
| Anti-mouse CD11c (HL3) | BD Pharmingen | 5580979 | PE-Cy7 conjugated |
| Anti-mouse I-A/I-E (269) | BD-Pharmingen | 553623 | FITC conjugated |
| Collangenase Type 1A | Sigma | 9891-500MG | |
| Cell strainers | BD Falcon | 352340, 352360 | |
| CD11c (N418) Microbeads | Miltenyi | 130-052-001 | |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Hank’s Balanced Salt solution | Invitrogen | 14170 | |
| Hepes buffer solution | Invitrogen | 15630 | |
| Petri dishes 60 mm | BD Falcon | 351016 | |
| GentleMACS™ C tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Gentle MACS dissociator | Miltentyi | 130-093-235 | |
| AutoMACS-Pro™ | Miltenyi | 130-092-545 | |
| FASCS Aria | BD |
Referências
- Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. Sensing pathogens and tuning immune responses. Science. 293, 253-256 (2001).
- Banchereau, J. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
- Manicassamy, S., Pulendran, B. Dendritic cell control of tolerogenic responses. Immunol. Rev. 241, 206-227 (2011).
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J. Exp. Med. 137, 1142-1162 (1973).
- Asselin-Paturel, C. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2, 1144-1150 (2001).
- Chan, C. W. Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity. Nat. Med. 12, 207-213 (2006).
- Taieb, J. A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance. Nat. Med. 12, 214-219 (2006).
- Guerrero-Plata, A., Kolli, D., Hong, C., Casola, A., Garofalo, R. P. Subversion of pulmonary dendritic cell function by paramyxovirus infections. Journal of Immunology. 182, 3072-3083 (2009).
- Larson, R. S., Springer, T. A. Structure and function of leukocyte integrins. Immunol. Rev. 114, 181-217 (1990).
- Sung, S. S. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J. Immunol. 176, 2161-2172 (2006).
- Wang, H. Local CD11c+ MHC class II- precursors generate lung dendritic cells during respiratory viral infection, but are depleted in the process. J. Immunol. 177, 2536-2542 (2006).
- Bhatia, S. Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance of alternatively activated phenotype. PLoS One. 6, e15943-e15943 (2011).
- Shao, Z., Makinde, T. O., McGee, H. S., Wang, X., Agrawal, D. K. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand regulates migratory pattern and antigen uptake of lung dendritic cell subsets in a murine model of allergic airway inflammation. J. Immunol. 183, 7531-75381 (2009).
- Hao, X., Kim, T. S., Braciale, T. J. Differential response of respiratory dendritic cell subsets to influenza virus infection. J. Virol. 82, 4908-4919 (2008).
