Isolamento di cellule polmonari mouse dendritiche
Summary
Una preparazione altamente purificato di cellule dendritiche del polmone del mouse è descritto. Particolare enfasi è data l'isolamento delle tradizionali sottoinsieme delle cellule dendritiche.
Abstract
Le cellule dendritiche del polmone (DC) svolgono un ruolo fondamentale nel rilevamento invadendo 1,2 patogeni così come nel controllo della risposta tollerogeniche 3 nel tratto respiratorio. Almeno tre principali sottoinsiemi di cellule dendritiche del polmone sono stati descritti nei topi: convenzionale DC (CDC) 4, plasmacitoidi DC (PDC) 5 e la produzione di IFN-DC assassino (IKDC) 6,7. Il sottoinsieme CDC è il sottoinsieme DC più importanti nel polmone 8.
Il marcatore comune noto per identificare sottoinsiemi DC è CD11c, un tipo mi transmembrana integrina (β2), che si esprime anche sui monociti, macrofagi, neutrofili e alcune cellule B 9. In alcuni tessuti, utilizzando CD11c come marcatore per identificare il mouse DC è valido, come nella milza, dove la maggior parte delle cellule + CD11c rappresentano il sottoinsieme CDC che esprime alti livelli del complesso maggiore di istocompatibilità di classe II (MHC-II). Tuttavia, il polmone è un tessuto più eterogeneo dove esseresottoinsiemi lato DC, vi è un'alta percentuale di una popolazione di cellule distinte che esprime alti livelli di CD11c attacco bassi livelli di MHC-II. Sulla base della sua caratterizzazione e soprattutto sulla sua espressione di F4/80, un marcatore dei macrofagi della milza, il CD11c hi-MHC II popolazione di cellule del polmone lo è stato identificato come i macrofagi polmonari 10 e più recentemente, come un potenziale precursore DC 11.
In contrasto con il mouse pDC, lo studio del ruolo specifico del CDC nella risposta immunitaria polmonare è stata limitata a causa della mancanza di un marcatore specifico che potrebbe aiutare a l'isolamento di queste cellule. Pertanto, in questo lavoro, si descrive una procedura per isolare altamente purificato del mouse polmone CDC. L'isolamento di polmonare sottoinsiemi DC rappresenta uno strumento molto utile per acquisire conoscenze in funzione di queste cellule in risposta a patogeni respiratori così come i fattori ambientali che possono innescare la risposta immunitaria nei polmoni.
Protocol
Discussion
Isolamento dei polmonare topo DC è una tecnica importante per lo studio di una vasta gamma di stimoli respiratori. Il processo per ottenere queste cellule include passaggi critici che impediscono la perdita di cellule così come la vitalità cellulare e la purezza. Perfusione del polmone prima della raccolta contribuirà a eliminare eventuali cellule periferiche e ridurre eritrociti contaminante. L'utilizzo della dissociazione automatico può essere advanteogus quando un gran numero di polmoni vengono gestiti, altr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare per Marilyn Dietrich presso l'impianto di core LSU Citometria a flusso per il suo aiuto con la separazione delle cellule e Peter Mottram per la sua assistenza con il microfotografie. Questo lavoro è stato finanziato dal Assistente di volo Medical Research Institute, l'LSU-competitivi Premio programma di ricerca, e il NIH / NIAID Borse P20 RR020159 e R03AI081171.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| ACK lysing buffer | Invitrogen | D6-0005DG | |
| Anti-mouse CD11c (HL3) | BD Pharmingen | 5580979 | PE-Cy7 conjugated |
| Anti-mouse I-A/I-E (269) | BD-Pharmingen | 553623 | FITC conjugated |
| Collangenase Type 1A | Sigma | 9891-500MG | |
| Cell strainers | BD Falcon | 352340, 352360 | |
| CD11c (N418) Microbeads | Miltenyi | 130-052-001 | |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Hank’s Balanced Salt solution | Invitrogen | 14170 | |
| Hepes buffer solution | Invitrogen | 15630 | |
| Petri dishes 60 mm | BD Falcon | 351016 | |
| GentleMACS™ C tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Gentle MACS dissociator | Miltentyi | 130-093-235 | |
| AutoMACS-Pro™ | Miltenyi | 130-092-545 | |
| FASCS Aria | BD |
Referências
- Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. Sensing pathogens and tuning immune responses. Science. 293, 253-256 (2001).
- Banchereau, J. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
- Manicassamy, S., Pulendran, B. Dendritic cell control of tolerogenic responses. Immunol. Rev. 241, 206-227 (2011).
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J. Exp. Med. 137, 1142-1162 (1973).
- Asselin-Paturel, C. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2, 1144-1150 (2001).
- Chan, C. W. Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity. Nat. Med. 12, 207-213 (2006).
- Taieb, J. A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance. Nat. Med. 12, 214-219 (2006).
- Guerrero-Plata, A., Kolli, D., Hong, C., Casola, A., Garofalo, R. P. Subversion of pulmonary dendritic cell function by paramyxovirus infections. Journal of Immunology. 182, 3072-3083 (2009).
- Larson, R. S., Springer, T. A. Structure and function of leukocyte integrins. Immunol. Rev. 114, 181-217 (1990).
- Sung, S. S. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J. Immunol. 176, 2161-2172 (2006).
- Wang, H. Local CD11c+ MHC class II- precursors generate lung dendritic cells during respiratory viral infection, but are depleted in the process. J. Immunol. 177, 2536-2542 (2006).
- Bhatia, S. Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance of alternatively activated phenotype. PLoS One. 6, e15943-e15943 (2011).
- Shao, Z., Makinde, T. O., McGee, H. S., Wang, X., Agrawal, D. K. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand regulates migratory pattern and antigen uptake of lung dendritic cell subsets in a murine model of allergic airway inflammation. J. Immunol. 183, 7531-75381 (2009).
- Hao, X., Kim, T. S., Braciale, T. J. Differential response of respiratory dendritic cell subsets to influenza virus infection. J. Virol. 82, 4908-4919 (2008).
