Isolamento de células dendríticas pulmonares do rato
Summary
A preparação altamente purificada de células dendríticas pulmonares do rato é descrito. Ênfase específica é dada para o isolamento de um subconjunto de células dendríticas convencionais.
Abstract
Células pulmonares dendríticas (DC) desempenham um papel fundamental na detecção invadindo 1,2 patógenos, bem como no controle de respostas tolerogênico 3 no trato respiratório. Pelo menos três subconjuntos principais de células dendríticas pulmonares têm sido descritas em ratos: DC convencional (CDC) 4, plasmocitóide DC (PDC) 5 e IFN-produzindo assassino DC (IKDC) 6,7. O subconjunto do CDC é o subconjunto DC mais proeminentes no pulmão 8.
O marcador comum conhecida para identificar subgrupos DC CD11c é, um tipo que eu transmembrana integrina (β2), que também é expresso em monócitos, macrófagos, neutrófilos e algumas células B 9. Em alguns tecidos, usando CD11c como um marcador para identificar rato DC é válido, como no baço, onde a maioria das células CD11c + representa o subconjunto do CDC que expressa altos níveis do complexo principal de histocompatibilidade classe II (MHC-II). No entanto, o pulmão é um tecido mais heterogêneo, onde sesubconjuntos lado DC, há uma elevada percentagem de uma população de células distintas que expressa altos níveis de CD11c combate os baixos níveis de MHC-II. Com base na sua caracterização e principalmente em sua expressão de F4/80, um marcador de macrófagos do baço, o CD11c oi MHC-II eis população de células do pulmão foi identificado como macrófagos pulmonares 10 e, mais recentemente, como um precursor potencial DC 11.
Em contraste com o rato pDC, o estudo do papel específico do CDC na resposta imunológica pulmonar tem sido limitado devido à falta de um marcador específico que poderia ajudar no isolamento dessas células. Portanto, neste trabalho, descrevemos um procedimento para isolar altamente purificado do mouse pulmão CDC. O isolamento de subconjuntos pulmonar DC representa uma ferramenta muito útil para obter insights sobre a função destas células em resposta a patógenos respiratórios, bem como fatores ambientais que podem desencadear a resposta imune do hospedeiro no pulmão.
Protocol
Discussion
Isolamento de pulmonar do rato DC é uma técnica importante para o estudo de uma ampla gama de estímulos respiratórios. O processo de obtenção dessas células inclui passos críticos que impedem a perda de células, bem como a viabilidade celular e pureza. Perfusão do pulmão antes da coleta ajudará a eliminar as células periféricas, bem como reduzir os eritrócitos contaminantes. O uso da dissociação automatizado pode ser advanteogus quando um grande número de pulmões são tratados, caso contrário, você …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Marilyn Dietrich no Centro de Núcleo LSU Citometria de Fluxo por sua ajuda com a separação de células e Mottram Peter por sua ajuda com as microfotografias. Este trabalho foi financiado pela Flight Attendant Medical Research Institute, da LSU-Competitiva Prêmio Programa de Pesquisa, e os subsídios NIH / NIAID P20 RR020159 e R03AI081171.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| ACK lysing buffer | Invitrogen | D6-0005DG | |
| Anti-mouse CD11c (HL3) | BD Pharmingen | 5580979 | PE-Cy7 conjugated |
| Anti-mouse I-A/I-E (269) | BD-Pharmingen | 553623 | FITC conjugated |
| Collangenase Type 1A | Sigma | 9891-500MG | |
| Cell strainers | BD Falcon | 352340, 352360 | |
| CD11c (N418) Microbeads | Miltenyi | 130-052-001 | |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Hank’s Balanced Salt solution | Invitrogen | 14170 | |
| Hepes buffer solution | Invitrogen | 15630 | |
| Petri dishes 60 mm | BD Falcon | 351016 | |
| GentleMACS™ C tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Gentle MACS dissociator | Miltentyi | 130-093-235 | |
| AutoMACS-Pro™ | Miltenyi | 130-092-545 | |
| FASCS Aria | BD |
Referências
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