Aislamiento de células dendríticas del pulmón de ratón
Summary
Una preparación altamente purificada de células dendríticas del pulmón del ratón se describe. Especial énfasis se da al aislamiento de subgrupo de células dendríticas convencionales.
Abstract
Las células pulmonares dendríticas (DC), juegan un papel fundamental en la detección de 1,2 patógenos invasores, así como en el control de las respuestas tolerogénicas 3 en el tracto respiratorio. Al menos tres subgrupos principales de las células dendríticas del pulmón se han descrito en ratones: CC convencionales (CDC) 4, plasmocitoide DC (PDC) 5 y el asesino DC IFN-producción (IKDC) 6,7. El subconjunto de los CDC es el subconjunto DC más destacados en el pulmón 8.
El marcador común conocida para identificar subgrupos de DC CD11c es, un tipo que la integrina transmembrana (β2) que también se expresa en monocitos, macrófagos, neutrófilos y algunas células B 9. En algunos tejidos, con CD11c como marcador para identificar ratón DC es válido, como en el bazo, donde la mayoría de las células CD11c + representan el subconjunto de los CDC, que expresa los altos niveles del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II (MHC-II). Sin embargo, el pulmón es un tejido más heterogénea, donde sesubconjuntos lado DC, hay un alto porcentaje de una población de células distintas que expresa los altos niveles de CD11c pelea niveles bajos de MHC-II. Con base en su caracterización y sobre todo en su expresión de F4/80, un marcador de macrófagos del bazo, el CD11c alta MHC-II pulmonar he población celular ha sido identificado como macrófagos pulmonares 10 y más recientemente, como un posible precursor de DC 11.
En contraste con el ratón PDC, el estudio de la función específica de los CDC en la respuesta inmune pulmonar ha sido limitado debido a la falta de un marcador específico que podría ayudar en el aislamiento de estas células. Por lo tanto, en este trabajo se describe un procedimiento para aislar altamente purificada de pulmón de ratón CDC. El aislamiento de los subconjuntos pulmonar DC representa una herramienta muy útil para obtener información sobre la función de estas células en respuesta a patógenos respiratorios, así como los factores ambientales que pueden desencadenar la respuesta inmune del huésped en el pulmón.
Protocol
Discussion
El aislamiento de DC pulmonar del ratón es una técnica importante para el estudio de una amplia gama de estímulos respiratorios. El proceso de obtención de estas células incluye los pasos críticos que impiden la pérdida de las células, así como la viabilidad celular y la pureza. Perfusión del pulmón antes de la recogida ayudará a eliminar las células periféricas, así como reducir los eritrocitos contaminantes. El uso de la disociación puede ser automatizado advanteogus cuando un gran número de los pulmo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Marilyn Dietrich en el Centro de Citometría de Flujo LSU central por su ayuda en la clasificación de células, y Mottram Pedro por su ayuda con las microfotografías. Este trabajo fue financiado por el Flight Attendant Medical Research Institute, el Premio de Investigación LSU-programa competitivo, y las subvenciones del NIH / NIAID P20 RR020159 y R03AI081171.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| ACK lysing buffer | Invitrogen | D6-0005DG | |
| Anti-mouse CD11c (HL3) | BD Pharmingen | 5580979 | PE-Cy7 conjugated |
| Anti-mouse I-A/I-E (269) | BD-Pharmingen | 553623 | FITC conjugated |
| Collangenase Type 1A | Sigma | 9891-500MG | |
| Cell strainers | BD Falcon | 352340, 352360 | |
| CD11c (N418) Microbeads | Miltenyi | 130-052-001 | |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Hank’s Balanced Salt solution | Invitrogen | 14170 | |
| Hepes buffer solution | Invitrogen | 15630 | |
| Petri dishes 60 mm | BD Falcon | 351016 | |
| GentleMACS™ C tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Gentle MACS dissociator | Miltentyi | 130-093-235 | |
| AutoMACS-Pro™ | Miltenyi | 130-092-545 | |
| FASCS Aria | BD |
Referências
- Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. Sensing pathogens and tuning immune responses. Science. 293, 253-256 (2001).
- Banchereau, J. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
- Manicassamy, S., Pulendran, B. Dendritic cell control of tolerogenic responses. Immunol. Rev. 241, 206-227 (2011).
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J. Exp. Med. 137, 1142-1162 (1973).
- Asselin-Paturel, C. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2, 1144-1150 (2001).
- Chan, C. W. Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity. Nat. Med. 12, 207-213 (2006).
- Taieb, J. A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance. Nat. Med. 12, 214-219 (2006).
- Guerrero-Plata, A., Kolli, D., Hong, C., Casola, A., Garofalo, R. P. Subversion of pulmonary dendritic cell function by paramyxovirus infections. Journal of Immunology. 182, 3072-3083 (2009).
- Larson, R. S., Springer, T. A. Structure and function of leukocyte integrins. Immunol. Rev. 114, 181-217 (1990).
- Sung, S. S. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J. Immunol. 176, 2161-2172 (2006).
- Wang, H. Local CD11c+ MHC class II- precursors generate lung dendritic cells during respiratory viral infection, but are depleted in the process. J. Immunol. 177, 2536-2542 (2006).
- Bhatia, S. Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance of alternatively activated phenotype. PLoS One. 6, e15943-e15943 (2011).
- Shao, Z., Makinde, T. O., McGee, H. S., Wang, X., Agrawal, D. K. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand regulates migratory pattern and antigen uptake of lung dendritic cell subsets in a murine model of allergic airway inflammation. J. Immunol. 183, 7531-75381 (2009).
- Hao, X., Kim, T. S., Braciale, T. J. Differential response of respiratory dendritic cell subsets to influenza virus infection. J. Virol. 82, 4908-4919 (2008).
