大型単層小胞へのペプチドの転座の測定
Summary
このプロトコルの詳細、大きな一枚膜脂質小胞へのペプチド移行の定量的測定のための方法。また、このメソッドは、膜の転座の割合に関する情報を提供し、効率的かつ自発的に脂質二重層を横切るペプチドを同定するために使用することができます。
Abstract
容易に細胞膜の受容体1の支援なしに細胞膜を通過ペプチドに積極的に関心があります。これらの多くは、頻繁に1から3の薬物送達ベクターとしての可能性で注目されて細胞透過性ペプチド、と呼ばれています。また、特に4,5以外の膜溶解メカニズム、細胞溶解を引き起こすことなく、細菌の膜を通過し、細胞内プロセス6,7に干渉することによって細胞を殺すものを介して動作抗菌ペプチドの関心が高まっている。実際に、著者らはますます細胞透過性と抗菌ペプチド1,8の間の関係を指摘している。膜の転座とペプチドの構造と転位する能力との関係のプロセスのしっかりとした理解は、転座のための効果的な、再現性のアッセイを必要とします。いくつかのグループは、大きなunilamelに転座を測定する手法を提案したLAR脂質小胞（LUVs）9-13 LUVsは、細菌と真核生物の細胞膜の有用なモデルとなると頻繁に14,15ペプチド蛍光の研究に使用されています。ここで、我々はまずそのようなマガイニンとbuforin II 16,17のような抗菌性ペプチドを、考慮する松崎と共同研究者によって開発された方法の我々のアプリケーションについて説明します。この方法のために我々のプロトコルを提供することに加えて、我々はまた、このアッセイを用いて転座の能力を定量データ分析への直接的なアプローチを提示する。他人と比較してこの転座アッセイの利点は、それが膜の転座の割合に関する情報を提供する可能性を秘めているとトリプトファン含有ペプチドにペプチドの特性18を 、変えることができる蛍光標識、の加算を必要としないことです。簡潔に、脂質小胞へのトランスロケーション機能は、ネイティブのトリプトファン残基とdの間にフォスターの共鳴エネルギー移動（FRET）の関数として測定されますタンパク質が外部に関連付けられているansylホスファチジルエタノールアミンは、膜（図1）LUVは。彼らはLUVsでカプセル化された制約のないトリプシンが発生したとして、細胞透過性ペプチドは、マブラヴ膜とFRETシグナルの減少から解離につながる、切断されています。 LUVsがトリプシンおよびトリプシンインヒビター、またはときに自発的に脂質膜を通過していないペプチドをトリプシン含有LUVsにさらされている両方が含まれているときに転位ペプチドで観察されたFRETシグナルの低下は、同一のペプチドで観察されたものよりかなり大きいです。蛍光の変化は、時間の経過ペプチド転座の直接定量を提供します。
Protocol
Discussion
ここで紹介するプロトコルは、内部および脂質小胞の外側のペプチドの濃度の相対的な変化を評価するために使用することができます。これらの変更は、転座の能力に関連しています。このプロトコルは、薬物送達ベクターとしての可能性と細胞透過性ペプチドを同定するために使用することができます。細胞透過性ペプチドへの関心が拡大するにつれ、それは直接転座のイベントを測定す?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、有用な議論をエレノアフレミングとジェシカ陳に感謝します。資金は、国立アレルギー感染病研究所（NIH – NIAID）賞R15AI079685とリサーチ株式会社コットレル大学科学賞によって提供されていました。追加の学生支援は、ハワードヒューズ医学研究所とStaley氏の資金によって提供されていました。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 16:0-18:1 PG | Avanti Polar Lipids | 840457C |
| 1:18 Dansyl PE | Avanti Polar Lipids | 810330C |
| 16:0-18:1 PC | Avanti Polar Lipids | 850457C |
| Porcine trypsin | Sigma | T-0303 |
| Bowman-Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor | Sigma | T-9777 |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 |
| Ammonium molybdate (para) | Alfa Aesar | 10811 |
| L-ascorbic acid | Sigma | A1417 |
| Hydrogen Peroxide, 30% solution | Mallinckrodt chemicals | 5240-05 |
| HEPES | Sigma | H-3375 |
| NaCl | Sigma | S-9625 |
| EDTA | Sigma | E5134 |
| NaH2PO4 | Sigma | S-0751 |
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