Detta protokoll detaljer en metod för kvantitativ mätning av peptiden translokation i stora unilamellar lipid blåsor. Denna metod ger också information om graden av membranet translokation och kan användas för att identifiera peptider som effektivt och spontant över lipid bilayers.
Det finns ett aktivt intresse för peptider som lätt passera cellmembran utan hjälp av receptorer på cellens membran 1. Många av dessa kallas cell-penetrerande peptider, som ofta är kända för sin potential som drug delivery vektorer 1-3. Dessutom finns ett ökat intresse för antimikrobiella peptider som verkar via icke-membran lytisk mekanismer 4,5, särskilt de som korsar bakteriemembran utan att orsaka cellslys och döda celler genom att störa intracellulära processer 6,7. I själva verket har författarna pekat alltmer ut förhållandet mellan cell-penetrerande och antimikrobiella peptider 1,8. En fast förståelse av processen membranet translokation och förhållandet mellan peptiden struktur och dess förmåga att translocate kräver effektiv, reproducerbara analyser för translokation. Flera grupper har föreslagit metoder för att mäta translokation i stora unilamelLAR lipid blåsor (LUVS) 9-13. LUVS fungera som användbara modeller för bakterier och eukaryota cellens membran och används ofta i peptid fluorescerande studier 14,15. Här beskriver vi vår tillämpning av metoden utvecklades först av Matsuzaki och medarbetare att överväga antimikrobiella peptider, som magainin och buforin II 16,17. Förutom att ge våra protokoll för denna metod, presenterar vi också en enkel metod för analys av data som anger translokationen förmåga att använda denna analys. Fördelarna med denna translokation analys jämfört med andra är att den har potential att ge information om graden av membranet förflyttning och inte kräver tillsats av en fluorescerande märkningen, som kan förändra peptid egenskaper 18, tryptofan som innehåller peptider. Kortfattat är translokation förmågan till lipid blåsor mätt som en funktion av Foster Resonance Energy Transfer (FRET) mellan infödda tryptofan rester och dansyl fosfatidyletanolamin när proteiner associerade med externa LUV membran (figur 1). Cellpenetrerande peptider klyvs när de möter hämningslös trypsin inkapslad med LUVS, vilket leder till avståndstagande från LUV membranet och en nedgång i FRET signal. Nedgången i FRET signalen observeras under en translocating peptid är betydligt större än den som observerades för samma peptiden när LUVS innehåller både trypsin och trypsin inhibitor, eller när en peptid som inte spontant över lipid membraner är utsatt för trypsin innehåller LUVS. Denna förändring i fluorescens ger en direkt kvantifiering av peptid translokationen över tiden.
Protokollet presenteras här kan användas för att bedöma den relativa förändringen i koncentration av peptider i och utanför lipid blåsor. Dessa förändringar är relaterade till translokation förmåga. Detta protokoll kan användas för att identifiera cellpenetrerande peptider med potential som vektorer drug delivery. Liksom intresset för cell-penetrerande peptider växer, kommer det att bli intressant att se hur metoder som direkt mäter translokation händelsen utvecklas och användas i en kvantitativ sät…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Eleanor Fleming och Jessica Chen för bra diskussioner. Finansieringen kom från National Institute of Allergy och infektionssjukdomar (NIH-NIAID) Tilldelningskriterier R15AI079685 och Research Corporation Cottrell College Science Award. Ytterligare studentstöd lämnades av Howard Hughes Medical Institute och Staley fonden.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
16:0-18:1 PG | Avanti Polar Lipids | 840457C |
1:18 Dansyl PE | Avanti Polar Lipids | 810330C |
16:0-18:1 PC | Avanti Polar Lipids | 850457C |
Porcine trypsin | Sigma | T-0303 |
Bowman-Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor | Sigma | T-9777 |
Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 |
Ammonium molybdate (para) | Alfa Aesar | 10811 |
L-ascorbic acid | Sigma | A1417 |
Hydrogen Peroxide, 30% solution | Mallinckrodt chemicals | 5240-05 |
HEPES | Sigma | H-3375 |
NaCl | Sigma | S-9625 |
EDTA | Sigma | E5134 |
NaH2PO4 | Sigma | S-0751 |