Demonstramos como configurar um In vitro Isquemia / reperfusão modelo e como avaliar o efeito da terapia com células-tronco em células cardíacas pós-isquêmica.
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Artigo de método
Transplante de Células-tronco em um In vitro Modelo de isquemia / reperfusão Simulated
Neste artigo
Resumo
Resumo
Protocolos de transplante de células-tronco estão encontrando seu caminho na prática clínica 1,2,3. Obter melhores resultados, fazendo com que os protocolos mais robustos, e encontrar novas fontes de células implantáveis são o foco de pesquisas recentes 4,5. Investigar a eficácia de terapias celulares não é uma tarefa fácil e novas ferramentas são necessários para investigar os mecanismos envolvidos no processo de tratamento 6. Nós projetamos um protocolo experimental de isquemia / reperfusão, a fim de permitir a observação de conexões celulares e mecanismos subcelulares mesmo durante a isquemia / reperfusão e após o transplante de células-tronco e para avaliar a eficácia da terapia celular. H9c2 cardiomyoblast células foram colocadas em placas de cultura de células 7,8. Isquemia foi simulado com 150 minutos em um meio de glicose livre com nível de oxigênio abaixo de 0,5%. Então, a mídia normal e os níveis de oxigênio foram reintroduzidos para simular reperfusão. Após a privação de glicose oxigênio,as células danificadas foram tratados com transplante de medula óssea humana rotulados derivados de células-tronco mesenquimais, adicionando-os à cultura. Células-tronco mesenquimais são as preferidas em ensaios clínicos, porque eles são facilmente acessíveis com cirurgia minimamente invasiva, facilmente expansível e autólogo. Após 24 horas de co-cultivo, as células foram coradas com calceína e de etídeo-homodímero de diferenciar entre células vivas e mortas. Esta configuração permitiu investigar as conexões intercelulares por microscopia de fluorescência confocal e quantificar a taxa de sobrevivência de células pós-isquêmica por citometria de fluxo. Microscopia confocal mostrou as interações das duas populações de células, tais como fusão celular e formação de nanotubos intercelular. Citometria de fluxo revelou três grupos de células danificadas que podem ser plotados em um gráfico e analisados estatisticamente. Essas populações podem ser investigados separadamente e conclusões podem ser tiradas destes dados sobre a eficácia do simuladoabordagem terapêutica.
Protocolo
1. Preparando H9c2 células cardiomyoblast
H9c2 cardiomyoblasts ratos foram obtidos a partir ATCC (Wesel, Alemanha) e ampliado em glicose (4,5 g / L) DMEM contendo 10% de soro fetal bovino, 4 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina e estreptomicina 100 mg / ml. O H9c2 linha celular de mioblastos é derivada de coração de rato embrionárias, é usada como um modelo in vitro para ambos os músculos esqueléticos e cardíaco 8,9.
Prepare 12 placa bem de H9c2 células:
- Remova o meio de cultura de Petri prato de H9c2 células.
- Lave as células duas vezes com 5 ml de PBS e digerir com 2-3 ml 0....
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Discussão
O protocolo demonstrado in vitro é uma abordagem para a questão muito mais complexa da terapia com células-tronco em infarto do miocárdio, com todas as vantagens e desvantagens de tal modelo. Obviamente, ele não pode refletir a complexa (imunológica, por exemplo) eventos que ocorrem durante e após infarto do miocárdio, mas pode se concentrar sobre os efeitos diretos das células adicionado nas células pós-isquêmica. Os efeitos da isquemia simulada sobre H9c2 cardiomyoblasts depende muito do tempo de OGD, sobre o número p.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela OTKA (Hungarian Fundo de Investigação Científica) D45933, T049621, TET (Hungarian Ciência e Tecnologia Foundation) A4/04, Arg-17/2006 e SIN, Bolyai, Bolsas e Öveges TÁMOP 4.2.2-08 / 1 / KMR-2008-0004 e 4.2.1 / B 09/1/KMR-2010-0001. OTKA 83803. Gostaríamos de agradecer Gesztes William para fornecer a voz-over.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| calceína-AM | Sondas moleculares | L3224, C3099 | http://www.invitrogen.com |
| homodímero de etídio-2 | Sondas moleculares | L3224, E3599 | http://www.invitrogen.com |
| Vybrant DiD | Sondas moleculares | V22887 | http://www.invitrogen.com |
Tabela 1. Reagentes.
| Nome do equipamento | Companhia | Comments (opcional) |
|---|---|---|
| Pecon sistema de incubação de células para microscópios Zeiss | Pecon GmbH | www.pecon.biz/ |
Equipamentos tabela 2..
Referências
- Dimmeler, S., Burchfield, J., Zeiher, A. M. Cell-Based Therapy of Myocardial Infarction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28, (2008).
- Kim, S. U., de Vellis, J. Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: A review. Journal of Neuroscience Research.
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Reimpressões e permissões
