تحليل التعبير عن الأنواع الفرعية رابط-هيستون الثدييات
Summary
نحن وصف مجموعة من فحوصات لتحليل مستويات التعبير من histones رابط H1. يتم قياسها كميا مرنا من الجينات H1 الفردية العشوائية النسخ العكسي التمهيدي استنادا تليها في الوقت الحقيقي PCR، في حين يتم تحقيق الكمي من البروتين histones H1 بواسطة تحليل HPLC.
Abstract
H1 هيستون رابط بربط الجسيمات الأساسية النيوكليوسومات والحمض النووي رابط، وتسهيل للطي من لونين إلى أعلى هيكل النظام. H1 أمر أساسي للتنمية الثدييات (1) وينظم محددة التعبير الجيني في الجسم الحي 2-4. بين البروتينات هيستون حفظا للغاية، والأسرة من histones رابط H1 هي مجموعة غير متجانسة أكثر. وهناك أنواع فرعية H1 11 في الثدييات التي تنظم بشكل مختلف خلال التنمية وأنواع مختلفة من الخلايا. هذه الأنواع الفرعية H1 منها 5 جسدية H1S (H1A الإلكترونية)، واستبدال H1 0، 4 جرثومة فرعية الخلية H1 محددة، وH1x 5. وجود أنواع فرعية H1 المتعددة التي تختلف في تقارب الحمض النووي ملزم لونين وقدرة الضغط 6-9 توفر مستوى إضافي من تعديل وظيفة من لونين. وبالتالي، التحليل الكمي التعبير عن الأنواع الفرعية H1 الفردية، وكلاهما من مرنا والبروتينات، أمر ضروري لفهم أفضل للتنظيم العاليترتيب هيكل لونين وظيفة.
نحن هنا وصف مجموعة من فحوصات تهدف لتحليل مستويات التعبير عن الأنواع الفرعية H1 الفردية (الشكل 1). ويتم قياس التعبير مرنا من مختلف الجينات البديل H1 من قبل مجموعة من حساسة للغاية وكمية النسخ المقايسات-PCR (qRT-PCR) العكسي، والتي هي أسرع وأكثر دقة وتتطلب عينات أقل بكثير بالمقارنة مع نهج بديل من تحليل لطخة الشمالية. وخلافا لمعظم غيرها من الرسائل الخلوية مرنا، mRNAs للجينات معظم هيستون، بما في ذلك غالبية الجينات H1، تفتقر إلى ذيل polyA طويل، ولكنها تحتوي على بنية الجذعية حلقة في المنطقة 3 'غير مترجمة (UTR) 10. لذلك، يتم إعداد cDNAs من مجموع بواسطة الحمض النووي الريبي النسخ العكسي باستخدام البادئات العشوائية بدلا من بنسبة ضئيلة من DT الاشعال. وتجرى فحوصات PCR الوقت الحقيقي مع الاشعال الخاصة بكل أنواع فرعية H1 (الجدول 1) للحصول على القياس الكمي للغاية من مستويات مرنا من النوع الفرعي H1 الفرديةق. ويتم تحليل التعبير عن الجينات التدبير المنزلي وضوابط للتطبيع.
يتم الحصول على الوفرة النسبية للبروتينات من كل سلالة H1 و histones الأساسية من خلال عكس اللوني المرحلة السائلة عالية الأداء (RP-HPLC) تحليل histones مجموع المستخرج من خلايا الثدييات 11-13. ووصف طريقة HPLC وشروط منح شطف هنا فصل الأمثل من أنواع فرعية H1 الماوس. عن طريق قياس الشخصية HPLC، قمنا بحساب الحصة النسبية من أنواع فرعية H1 الفردية داخل الأسرة H1، وكذلك تحديد من H1 إلى نسبة النيوكليوسومات في الخلايا.
Protocol
Discussion
قدمت مجموعة من فحوصات هنا تمكين تحليل شامل لمستويات التعبير عن الأنواع الفرعية الثدييات هيستون رابط. صمم بشكل صحيح qRT-PCR المقايسات توفير قياسات حساسة للغاية ودقيقة من الرسائل من أي جينات الحمض النووي الريبي هيستون H1 الثدييات. وجزء هام من qRT-PCR المقايسات لرابط جينات سل?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح GM085261 وسرطان جورجيا التحالف المتميز جائزة الباحث (إلى YF).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780 |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-018 |
| SuperScriptIII | Invitrogen | 18080-051 |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 |
| IQ SYBR Green | Bio-Rad | 170-8880 |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | AMP-D1 |
| Microseal 96-well PCR plate | Bio-Rad | MSP-9605 |
| Microseal ‘B’ Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 |
| Sucrose | Agros Organics | AC40594 |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP332 |
| Sodium chloride (NaCl) | American Bioanalytical | AB01915 |
| Sodium dihydrogen phosphate heptahydrate (NaH2PO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP-330 |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 |
| Complete Mini proteinase inhibitor cocktail tablet | Roche Applied Science | 11836153001 |
| EDTA | Sigma | E-5134 |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | American Bioanalytical | AB01620 |
| Nonidet-40 (NP-40) | American Bioanalytical | AB01425 |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 |
| Tris [hydroxymethyl aminomethane] | American Bioanalytical | AB02000 |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | VWR | VW3648-3 |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Agros Organics | AC42330 |
| Bradford Protein Assay | Bio-Rad | 500-0001 |
| Acetonitrile | EMD | AX0145-1 |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | J.T.Baker | 9470-01 |
Referências
- Fan, Y. H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo. Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).
- Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length. Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).
- Shen, X., Gorovsky, M. A. Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo. Cell. 86, 475-483 (1996).
- Alami, R. Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).
- Happel, N., Doenecke, D. Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function. Gene. 431, 1-12 (2009).
- Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF. PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).
- Khadake, J. R., Rao, M. R. DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin. Bioquímica. 34, 15792-15801 (1995).
- Orrego, M. Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin. BMC Biol. 5, 22-22 (2007).
- Th’ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain. J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).
- Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation. J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).
- Brown, D. T., Sittman, D. B. Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes. J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).
- Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype. Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).
- Fan, Y., Skoultchi, A. I. Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice. Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
