Expression Analys av däggdjur Linker-histon Subtyper
Summary
Vi beskriver en uppsättning av analyser för att analysera expressionsnivåer av histoner H1 linker. mRNA av enskilda H1 gener kvantitativt mäts genom slumpmässig primer omvänd transkription följt av realtids-PCR, medan protein kvantifiering av H1 histoner uppnås genom HPLC-analys.
Abstract
Linker histon H1 binder till nukleosomen kärnan partikel-och linker-DNA, vilket underlättar vikning av kromatin i högre ordningens struktur. H1 är en förutsättning för däggdjurens utveckling 1 och reglerar genuttryck in vivo 2-4. Bland de högkonserverade histonproteiner är familjen H1 länkare histoner mest heterogen grupp. Det finns 11 H1 subtyper i däggdjur som är differentiellt reglerade under utveckling och i olika celltyper. Dessa H1 subtyper inkluderar 5 somatisk H1S (H1A-e), ersättning H1 0, 4 könsceller specifika subtyper H1 och H1x 5. Närvaron av flera H1 subtyper som skiljer i DNA bindningsaffinitet och kromatin packning förmåga 6-9 ger en extra nivå av modulering av kromatin funktion. Således är kvantitativt uttryck analys av enskilda H1 subtyper, både mRNA och proteiner, som är nödvändiga för bättre förståelse av regleringen av högreFör kromatin struktur och funktion.
Här beskriver vi en uppsättning av analyser utformade för att analysera de expressionsnivåer av individuella H1 subtyper (figur 1). mRNA uttryck av olika gener H1 variant mäts av en uppsättning av mycket känsliga och kvantitativ omvänd transkription-PCR (QRT-PCR) analyser, som är snabbare, mer exakt och kräver mycket mindre prover jämfört med den alternativa synsätt Northern blot analys. Skillnad från de flesta andra cellulära mRNA-meddelanden, mRNA för de flesta histon gener, inklusive de flesta H1 gener, saknar en lång polyA-svans, men innehåller en stam-slingstruktur vid 3 'otranslaterade regionen (UTR) 10. Därför cDNA framställdes från totalt RNA genom omvänd transkription med användning av slumpmässiga primrar istället för oligo-dT-primrar. Realtid PCR-analyser med primrar som är specifika för vardera H1 subtyper (tabell 1) utförs för att erhålla hög grad kvantitativ mätning av mRNA-nivåer av individuella H1 subtyps. Uttryck av housekeeping gener analyseras som kontroller för normalisering.
Den relativa förekomsten av proteiner av varje subtyp H1 och histoner centrala erhålles genom omvänd fas högpresterande vätskekromatografi (RP-HPLC)-analys av totala histoner extraherade från däggdjursceller 11-13. HPLC metod och elueringsbetingelser beskrivs här ger optimala separationer av subtyp mus H1. Genom att kvantifiera HPLC-profilen, beräknar vi den relativa andelen av enskilda H1 subtyper inom H1 familjen, samt bestämma H1 till nukleosomen förhållandet i cellerna.
Protocol
Discussion
Uppsättningen av analyser presenteras här medge detaljerade analyser av uttrycket nivåerna av däggdjur länkare histon subtyper. Rätt utformade QRT-PCR-analyser ger mycket känsliga och noggranna mätningar av RNA meddelanden från alla däggdjur histon H1 gener. Den kritiska delen av QRT-PCR-analyser för länkare histon subtyp gener är framställning av cDNA med slumpmässig primer baserad omvänd transkription. mRNA av de flesta histon gener, inklusive de flesta H1 gener, innehåller inte en lång poly-A svans …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av NIH bidrag GM085261 och Georgia Cancer Coalition Distinguished Scholar Award (till YF).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780 |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-018 |
| SuperScriptIII | Invitrogen | 18080-051 |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 |
| IQ SYBR Green | Bio-Rad | 170-8880 |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | AMP-D1 |
| Microseal 96-well PCR plate | Bio-Rad | MSP-9605 |
| Microseal ‘B’ Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 |
| Sucrose | Agros Organics | AC40594 |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP332 |
| Sodium chloride (NaCl) | American Bioanalytical | AB01915 |
| Sodium dihydrogen phosphate heptahydrate (NaH2PO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP-330 |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 |
| Complete Mini proteinase inhibitor cocktail tablet | Roche Applied Science | 11836153001 |
| EDTA | Sigma | E-5134 |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | American Bioanalytical | AB01620 |
| Nonidet-40 (NP-40) | American Bioanalytical | AB01425 |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 |
| Tris [hydroxymethyl aminomethane] | American Bioanalytical | AB02000 |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | VWR | VW3648-3 |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Agros Organics | AC42330 |
| Bradford Protein Assay | Bio-Rad | 500-0001 |
| Acetonitrile | EMD | AX0145-1 |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | J.T.Baker | 9470-01 |
Referências
- Fan, Y. H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo. Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).
- Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length. Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).
- Shen, X., Gorovsky, M. A. Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo. Cell. 86, 475-483 (1996).
- Alami, R. Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).
- Happel, N., Doenecke, D. Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function. Gene. 431, 1-12 (2009).
- Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF. PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).
- Khadake, J. R., Rao, M. R. DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin. Bioquímica. 34, 15792-15801 (1995).
- Orrego, M. Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin. BMC Biol. 5, 22-22 (2007).
- Th’ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain. J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).
- Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation. J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).
- Brown, D. T., Sittman, D. B. Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes. J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).
- Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype. Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).
- Fan, Y., Skoultchi, A. I. Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice. Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
