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Micróbios têm complexo de vias metabólicas que podem ser investigados usando métodos de bioquímica e funcional genômica. Uma técnica importante examinar o metabolismo celular central e descobrir novas enzimas é de 13 C-assistida análise metabolismo 1. Esta técnica é baseada na rotulagem isotópica, em que os micróbios são alimentados com um 13 substratos C rotulados. Ao traçar os caminhos átomo de transição entre metabólitos na rede bioquímicos, podemos determinar caminhos funcional e descobrir novas enzimas.
Como um método complementar para transcriptômica e proteômica, abordagens para isotopomer assistida análise de vias metabólicas conter três etapas principais 2. Primeiro, cultivar células com 13 substratos C rotulados. Nesta etapa, a composição do meio e da seleção de substratos marcados são dois fatores-chave. Para evitar ruídos de medição a partir de carbono não-rotulados de suplementos nutricionais, Um meio mínimo com uma única fonte de carbono é necessária. Além disso, a escolha de um substrato marcado é baseada em como efetivamente ele irá elucidar o caminho a ser analisada. Porque muitas vezes envolvem enzimas romance estereoquímica reação diferente ou produtos intermediários, em geral, substratos de carbono individualmente rotulados são mais informativos para a detecção de caminhos novos do que os uniformemente marcado para a detecção de vias novela 3, 4. Em segundo lugar, analisar os padrões de rotulagem de aminoácidos usando GC -MS. Aminoácidos são abundantes em proteínas e, portanto, pode ser obtido a partir da hidrólise da biomassa. Aminoácidos pode ser derivatizado por N-(terc-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) antes da separação GC. TBDMS derivatizado aminoácidos pode ser fragmentado por MS e resultam em diferentes matrizes de fragmentos. Com base na massa à relação de carga (m / z) de fragmentação e não fragmentado aminoácidos, podemos deduzir os padrões possíveis rotulados dos metabólitos que são centraisprecursores dos aminoácidos. Terceiro, traçamos transições de carbono 13C nas vias propostas e, com base nos dados isotopomer, confirmar se estes caminhos são dois ativos. Medição de aminoácidos fornece informações de rotulagem isotópica cerca de oito metabólitos precursor crucial no metabolismo central. Esses nós metabólicos chave podem refletir as funções de associados vias centrais.
13 A análise do metabolismo C-assistida via proteinogénicos aminoácidos pode ser amplamente utilizado para a caracterização funcional de mal-caracterizada metabolismo microbiano 1. Neste protocolo, usaremos Cyanothece 51142 como cepa modelo para demonstrar o uso de substratos de carbono marcado para descobrir novas funções enzimáticas.