Kvantitativ analyse af Random migration af celler Brug af Time-lapse Video Microscopy
Summary
Denne fremgangsmåde tillader overvågning af celler i realtid og kvantitative målinger af forskellige cellemigrering parametre såsom hastighed, forskydning og hastighed. I modsætning til de traditionelle metoder, er dette realtime strategi ikke er baseret på endpoint kvantitative migration målinger, i stedet giver mulighed for overvågning og beregning af forskellige parametre kontinuerligt.
Abstract
Cellemigration er en dynamisk proces, hvilket er vigtigt for embryonisk udvikling, vævsreparation, immunsystem, og tumorinvasion 1, 2. Under retningsbestemt migration, bevæger celler hurtigt i respons på et ekstracellulært kemotaktisk signal, eller som reaktion på iboende signaler 3, som det grundlæggende motilitet maskinen. Tilfældigt migration forekommer, når en celle har lav indre retningsbestemthed, således at cellerne undersøge deres lokale miljø.
Cell migration er en kompleks proces, i det første svar cellen undergår polarisering og udvider fremspring i retning af migration 2. Traditionelle metoder til måling af migration såsom Boyden-kammer migration assay er en let metode til at måle kemotaksi in vitro, hvilket muliggør måling migration som et slutpunkt resultat. Men denne fremgangsmåde hverken tillader måling af de enkelte migration parametre, ligesom det heller ikke muligt at visuasering af morfologiske ændringer, som cellen undergår i løbet af migration.
Her præsenterer vi en metode, der giver os mulighed for at overvåge vandrende celler i realtid ved hjælp af video – tidsforskydningen mikroskopi. Siden celle migration og invasion er kendetegnende for kræft, vil denne metode kunne anvendes til at studere kræft celle migration og invasion in vitro. Tilfældig migration af blodplader er blevet betragtet som en af parametrene for trombocytfunktionen 4, derfor denne metode kunne også være nyttigt i at studere blodplade funktioner. Dette assay har den fordel at være hurtig, pålidelig, reproducerbar og ikke kræver optimering af celleantal. For at opretholde fysiologisk egnede betingelser for celler, er mikroskop udstyret med CO2 forsyning og temperatur termostat. Cellebevægelse overvåges ved at tage billeder ved hjælp af et kamera er monteret på mikroskop ved regelmæssige mellemrum. Cellemigration kan beregnes ved at måle den gennemsnitlige hastighed, og enGennemsnitligt forskydning, der beregnes ved Slidebook software.
Protocol
Discussion
Den virkelige tid tilfældige migration analysen muliggør præcis, følsom, analyse af cellemigration parametre såsom hastighed og forskydning. Denne fremgangsmåde er ikke begrænset til slutpunkt måleværdien, og det er derfor mere kvantitativ. Da cellerne overvåges under normal DMEM-medium med serum, og det reducerer den skadelige virkning af længere inkubation i serumfrie medier. Det har vist sig, at migreringen af celler afhænger af formateringen og bryde celle-kontakter med substratet 8, således …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Amanda Struckhoff for den indledende hjælp til eksperimentet. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra NIH 5RO1CA115706.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | |
| FBS | Gemini Bio- Products | 100-106 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985-070 | |
| Collagen | BD | 354231 | |
| Microscope with Live Cell chamber & Automated XY stage controller | Olympus | Olympus 1X81 | |
| Environmental control chamber | Neue | Neue Live Cell Chamber | Ours has a custom built rectangular glass plate top for appropriate optics through the top of the chamber. The rectangular shape accommodates multi-well plates used in many of our experiments. |
| Automated XY stage | Prior | Prior Proscan | This allows precise return to multiply selected XY positions during time lapse microscopy. |
| Camera | Hamamatsu EM camera C9100 | ||
| Software | Typically purchased through microscope vendor such as Olympus | Slide Book 5 |
Referências
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84, 359-369 (1996).
- Ridley, A. J. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302, 1704-1709 (2003).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
- Valone, F. H., Austen, K. F., Goetzl, E. J. Modulation of the random migration of human platelets. J. Clin. Invest. 54, 1100-1106 (1974).
- Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. Acquisition speed comparison of microscope software programs. Microsc. Res. Tech. 74, 539-545 (2011).
- Struckhoff, A. P. Dynamic regulation of ROCK in tumor cells controls CXCR4-driven adhesion events. J. Cell. Sci. 123, 401-412 (2010).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophoton. Internat. 11, 36-42 (2004).
- Greenberg, J. H., Seppa, S., Seppa, H., Tyl Hewitt, A. Role of collagen and fibronectin in neural crest cell adhesion and migration. Dev. Biol. 87, 259-266 (1981).
- Albini, A., Sporn, M. B. The tumour microenvironment as a target for chemoprevention. Nat. Rev. Cancer. 7, 139-147 (2007).
- Yu, Y. P., Luo, J. H. Myopodin-mediated suppression of prostate cancer cell migration involves interaction with zyxin. Cancer. Res. 66, 7414-7419 (2006).
- Teng, T. S., Lin, B., Manser, E., Ng, D. C., Cao, X. Stat3 promotes directional cell migration by regulating Rac1 activity via its activator betaPIX. J. Cell. Sci. 122, 4150-4159 (2009).
- Wozniak, M. A., Kwong, L., Chodniewicz, D., Klemke, R. L., Keely, P. J. R-Ras controls membrane protrusion and cell migration through the spatial regulation of Rac and Rho. Mol. Biol. Cell. 16, 84-96 (2005).
- Orr, A. W., Elzie, C. A., Kucik, D. F., Murphy-Ullrich, J. E. Thrombospondin signaling through the calreticulin/LDL receptor-related protein co-complex stimulates random and directed cell migration. J. Cell Sci. 116, 2917-2927 (2003).
- Smith, A., Bracke, M., Leitinger, B., Porter, J. C., Hogg, N. LFA-1-induced T cell migration on ICAM-1 involves regulation of MLCK-mediated attachment and ROCK-dependent detachment. J. Cell Sci. 116, 3123-3133 (2003).
