Quantitative Analyse der ungerichtete Migration von Zellen unter Verwendung Zeitraffer-Video-Mikroskopie
Summary
Diese Methode ermöglicht das Monitoring von Zellen in Echtzeit und quantitative Messungen verschiedener Zell-Migration Parameter wie Geschwindigkeit, Weg und Geschwindigkeit. Im Gegensatz zu den herkömmlichen Methoden ist diese Echtzeit-Ansatz nicht auf Endpunkt quantitativen Migration der Grundlage von Messungen, sondern es ermöglicht die Überwachung und Berechnung verschiedener Parameter kontinuierlich.
Abstract
Die Zellmigration ist ein dynamischer Prozess, das ist wichtig für die Embryonalentwicklung, die Reparatur von Gewebe, die Funktion des Immunsystems und Tumorinvasion 1, 2. Während gerichtete Migration, zu bewegen Zellen schnell in Reaktion auf eine extrazelluläre chemotaktischen Signal oder in Reaktion auf intrinsische Signale 3 durch die grundlegende Motilität Maschine bereitgestellt. Zufällige Migration tritt auf, wenn eine Zelle besitzt niedrige intrinsische Richtwirkung, so dass die Zellen, um ihre lokale Umgebung zu erkunden.
Die Zellmigration ist ein komplexer Prozess, in der ursprünglichen Antwort Zelle erfährt Polarisation und erstreckt sich Vorsprünge in der Richtung der Wanderung 2. Traditionelle Methoden zur Migration, wie der Boyden-Kammer Assay die Migration zu messen, ist eine einfache Methode, Chemotaxis in vitro, die Messung der Migration als Endpunkt Ergebnis erlaubt zu messen. Doch dieser Ansatz weder erlaubt die Messung der einzelnen Parameter Migration, noch erlauben zu visuasierung von morphologischen Veränderungen erfährt, dass die Zelle während der Migration.
Hier präsentieren wir eine Methode, die uns zu wandernden Zellen in Echtzeit per Video überwachen können – Zeitraffer-Mikroskopie. Da Zellmigration und Invasion Kennzeichen von Krebs sind, wird diese Methode anwendbar sein bei der Untersuchung von Krebszellen Migration und Invasion in vitro. Zufällige Migration von Plättchen nach einem der Parameter der Thrombozytenfunktion 4 wurde erlaubt, damit dieses Verfahren könnte auch nützlich sein bei der Untersuchung Plättchenfunktionen. Dieser Assay hat den Vorteil, dass die schnelle, zuverlässige und reproduzierbare, und erfordert keine Optimierung der Zellzahlen. Um physiologisch geeigneten Bedingungen für die Zellen zu erhalten, wird das Mikroskop mit CO 2-Versorgung und Thermostat ausgestattet. Zellbewegung wird durch das Fotografieren mit einer Kamera ausgestattet, um dem Mikroskop in regelmäßigen Abständen überwacht. Die Zellmigration durch Messung der mittleren Geschwindigkeit und einer berechneten werdenurchschnittliche Verschiebung, die durch Slidebook Software berechnet wird.
Protocol
Discussion
Die Echtzeit ungerichtete Migration Assay ermöglicht die präzise, sensibel, Analyse der Zellmigration Parameter wie Geschwindigkeit und Auslenkung. Diese Methode beschränkt sich nicht Punkt Messwert zu beenden, daher ist es mehr quantitativ. Da die Zellen in DMEM-Medium mit normalem Serum überwacht, senkt die schädliche Wirkung von längerer Inkubation in serumfreiem Medium. Es hat sich gezeigt, dass die Migration von Zellen auf die Formatierung und Brechungszelle Kontakte mit dem Substrat 8, so ka…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Amanda Struckhoff für die erste Hilfe mit dem Experiment zu danken. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus NIH 5RO1CA115706 unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | |
| FBS | Gemini Bio- Products | 100-106 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985-070 | |
| Collagen | BD | 354231 | |
| Microscope with Live Cell chamber & Automated XY stage controller | Olympus | Olympus 1X81 | |
| Environmental control chamber | Neue | Neue Live Cell Chamber | Ours has a custom built rectangular glass plate top for appropriate optics through the top of the chamber. The rectangular shape accommodates multi-well plates used in many of our experiments. |
| Automated XY stage | Prior | Prior Proscan | This allows precise return to multiply selected XY positions during time lapse microscopy. |
| Camera | Hamamatsu EM camera C9100 | ||
| Software | Typically purchased through microscope vendor such as Olympus | Slide Book 5 |
Referências
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84, 359-369 (1996).
- Ridley, A. J. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302, 1704-1709 (2003).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
- Valone, F. H., Austen, K. F., Goetzl, E. J. Modulation of the random migration of human platelets. J. Clin. Invest. 54, 1100-1106 (1974).
- Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. Acquisition speed comparison of microscope software programs. Microsc. Res. Tech. 74, 539-545 (2011).
- Struckhoff, A. P. Dynamic regulation of ROCK in tumor cells controls CXCR4-driven adhesion events. J. Cell. Sci. 123, 401-412 (2010).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophoton. Internat. 11, 36-42 (2004).
- Greenberg, J. H., Seppa, S., Seppa, H., Tyl Hewitt, A. Role of collagen and fibronectin in neural crest cell adhesion and migration. Dev. Biol. 87, 259-266 (1981).
- Albini, A., Sporn, M. B. The tumour microenvironment as a target for chemoprevention. Nat. Rev. Cancer. 7, 139-147 (2007).
- Yu, Y. P., Luo, J. H. Myopodin-mediated suppression of prostate cancer cell migration involves interaction with zyxin. Cancer. Res. 66, 7414-7419 (2006).
- Teng, T. S., Lin, B., Manser, E., Ng, D. C., Cao, X. Stat3 promotes directional cell migration by regulating Rac1 activity via its activator betaPIX. J. Cell. Sci. 122, 4150-4159 (2009).
- Wozniak, M. A., Kwong, L., Chodniewicz, D., Klemke, R. L., Keely, P. J. R-Ras controls membrane protrusion and cell migration through the spatial regulation of Rac and Rho. Mol. Biol. Cell. 16, 84-96 (2005).
- Orr, A. W., Elzie, C. A., Kucik, D. F., Murphy-Ullrich, J. E. Thrombospondin signaling through the calreticulin/LDL receptor-related protein co-complex stimulates random and directed cell migration. J. Cell Sci. 116, 2917-2927 (2003).
- Smith, A., Bracke, M., Leitinger, B., Porter, J. C., Hogg, N. LFA-1-induced T cell migration on ICAM-1 involves regulation of MLCK-mediated attachment and ROCK-dependent detachment. J. Cell Sci. 116, 3123-3133 (2003).
