Análisis cuantitativo de la migración desordenada de las células mediante microscopía de Time-lapse vídeo

Summary

Este método permite la monitorización de las células en tiempo real y las mediciones cuantitativas de los diferentes parámetros de la migración, como la velocidad, el desplazamiento y la velocidad. A diferencia de los métodos tradicionales, este enfoque en tiempo real no se basa en las mediciones cuantitativas de migración de punto final, sino que permite el seguimiento y el cálculo de diferentes parámetros de forma continua.

Abstract

La migración celular es un proceso dinámico, que es importante para el desarrollo embrionario, la reparación de tejidos, la función del sistema inmune, y la invasión tumoral ^{de 1, 2.} Durante la migración direccional, las células se mueven rápidamente en respuesta a una señal quimiotáctica extracelular, o en respuesta a las señales intrínsecas ³ proporcionados por la maquinaria motilidad de base. La migración al azar se produce cuando una célula posee direccionalidad intrínseca baja, permitiendo que las células de explorar su medio ambiente local.

Migración celular es un proceso complejo, en la celda de la respuesta inicial se somete a la polarización y se extiende protuberancias en la dirección de migración ^2. Los métodos tradicionales para medir la migración tal como el ensayo de migración de Boyden cámara es un método sencillo para medir la quimiotaxis in vitro, que permite medir la migración como un resultado punto final. Sin embargo, este enfoque no permite la medición de los parámetros individuales de migración, ni permite que Visualización de los cambios morfológicos que sufre durante la migración celular.

A continuación, presentamos un método que nos permite monitorear la migración de células en tiempo real mediante video – microscopía de lapso de tiempo. Dado que la migración celular y la invasión son el sello distintivo del cáncer, este método será de aplicación en el estudio de la migración de las células cancerosas y la invasión in vitro. Migración aleatoria de las plaquetas se ha considerado como uno de los parámetros de la función plaquetaria ^4, por lo tanto, este método también podría ser útil en el estudio de las funciones plaquetarias. Este ensayo tiene la ventaja de ser rápido, reproducible, fiable y no requiere la optimización del número de células. Con el fin de mantener las condiciones fisiológicamente adecuados para las células, el microscopio está equipado con CO ₂ de suministro y el termostato de la temperatura. Movimiento de las células es controlado por la toma de fotografías con una cámara instalada en el microscopio, a intervalos regulares. Migración de la célula puede ser calculado por la medición de velocidad media y unael desplazamiento PROMEDIO, que se calcula por el software Slidebook.

Protocol

1. Preparación de la placa recubierta de colágeno Diluir colágeno a una concentración final de 10 mg / ml en medio Opti-Mem medios. Escudo 6 y placas con colágeno, mediante la adición de 1,5 ml de la etapa 1 a cada pocillo. Incubar toda la noche a 4 ° C. Al día siguiente, se lava la placa 2 veces con fosfato 1x buffer salino (PBS) y almacenarlos en PBS. 2. Preparación y la siembra de células en una placa de 6 pocillos …

Discussion

El ensayo de tiempo real la migración al azar permite precisa, el análisis sensible, de los parámetros de la migración de células tales como la velocidad y el desplazamiento. Este método no se limita a terminar valor del punto de medición, por lo que es más cuantitativo. Puesto que, las células se controlan en condiciones normales de medio DMEM con suero, reduce el efecto deletéreo de incubación más largo en medio libre de suero. Se ha demostrado que la migración de las células depende de el formato y romp…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
DMEM	Thermo Scientific	SH30243.01
FBS	Gemini Bio- Products	100-106
Opti-Mem	Invitrogen	31985-070
Collagen	BD	354231
Microscope with Live Cell chamber & Automated XY stage controller	Olympus	Olympus 1X81
Environmental control chamber	Neue	Neue Live Cell Chamber	Ours has a custom built rectangular glass plate top for appropriate optics through the top of the chamber. The rectangular shape accommodates multi-well plates used in many of our experiments.
Automated XY stage	Prior	Prior Proscan	This allows precise return to multiply selected XY positions during time lapse microscopy.
Camera		Hamamatsu EM camera C9100
Software	Typically purchased through microscope vendor such as Olympus	Slide Book 5