Vi præsenterer en high-throughput flowcytometrisk analyse for at bestemme fagocyterende aktivitet af antigen-specifikke antistoffer fra kliniske prøver, at udnytte fluorescerende antigen-belagt perler og en monocytic cellelinie udtrykker flere Fc receptorer-leverandører receptor brug og fagocyterende aktivitet bestemmelser på en standardiseret og reproducerbare mode for enhver antigen af interesse.
Antistof-drevet fagocytose er induceret via ansættelse af Fc receptorer på professionelle fagocytter, og kan bidrage til både clearance samt patologi af sygdom. Mens egenskaberne for den variable domæner af antistoffer længe har været betragtet kritisk til in vivo-funktionen, har evnen af antistoffer til at rekruttere medfødte immunceller via deres Fc domæner bliver mere og mere værdsat som en vigtig faktor for deres effektivitet, både i etableringen af rekombinant monoklonalt antistof terapi, såvel som i løbet af naturlig infektion eller vaccination 1-3.
Vigtigere er det, på trods af sin nomenklatur som en konstant domæne, gør antistof-Fc-domæne ikke er konstant funktion, og er stærkt moduleres af IgG subklasser (IgG1-4) og glykosylering på asparagin 297 4-6. Således at denne metode undersøge funktionelle forskelle i antigen-specifikke antistoffer i kliniske prøver vil lette korrelation af fagocyterende puljenential af antistoffer mod sygdommen tilstand, modtagelighed for infektion, progression, eller det kliniske resultat.
Desuden er dette effektor funktion er særlig vigtig i lyset af den dokumenterede evne til antistoffer til at øge smitte ved at give patogener adgang til værtsceller via Fc receptor-drevet fagocytose 7. Desuden er der tegn på, at fagocyterende optagelsen af immunkomplekser kan påvirke Th1/Th2 polarisering af immunresponset 8.
Her beskriver vi en assay designet til at detektere forskelle i antistof-induceret fagocytose, som kan være forårsaget af forskellen IgG subklasse, glycan struktur på Asn297, samt evnen til at danne immunkomplekser af antigen-specifikke antistoffer i en high-throughput fashion . Til dette formål er 1 μm fluorescerende perler belagt med antigen, inkuberes derefter med kliniske antistof prøver, genererer fluorescerende antigen specifikke immunkomplekser. Disse antibody-opsonized perler inkuberes derefter med et monocytic cellelinie udtrykker flere FcγRs, herunder både hæmmende og aktiverende. Assay udgang kan omfatte fagocyterende aktivitet, cytokin sekretion, og mønstre for FcγRs brug, og fastsættes på en standardiseret måde, hvilket gør dette til et særdeles nyttigt system til parsing forskelle i dette antistof-afhængige effektor funktion i både infektion og vaccine-medieret beskyttelse 9.
Analysen, der er beskrevet her, giver high-throughput analyse af fagocyterende aktivitet af kliniske antistof prøver ved hjælp af et monocytic cellelinie længe udnyttet til at studere fagocyterende processer 10 og plade baseret automatiseret flowcytometri. Denne analyse er en fordel over andre i sin evne til præcist at karakterisere antigen-specifikt antistof delmængder, så ikke kun for Undersøgelse af forskelle i fagocytose drevet af sygdoms-specifikke antistoffer fra forskellige fag, men også undersøgelse af flere antigen særlige forhold inden for samme emne. Fordi antistof rekruttering af medfødte effektor celler, herunder monocytter og andre antigen-præsenterende celler kraftigt konsekvenser sygdommen resultatet 11-13, og er biologisk variabel afhængig antistof geometri, IgG subklasse, og glykosylering på Asparagine297 af Fc domainet 14-16, denne metode giver evaluering af en kritisk antistof virkningsmekanisme. Hertil kommer, fordi antistof-medicinated fagocytose bliver udnyttet af nogle patogener i løbet af infektion 7,17,18, denne analyse holder løfte i evaluering af forløbet af antistof-afhængige ekstraudstyr, og fremhæver den dobbelte karakter af fagocytose som et potentielt beskyttende, samt potentielt skadelige antistof aktivitet.
De beskrevne test kan bruges til at analysere antistoffer fra kliniske prøver af patientgrupper, men også af de vaccinerede, og kan tilpasses til at bruge serum snarere end oprenset IgG. Derudover kan cytokin sekretion som reaktion på fagocytose kan analyseres ud fra den kultur supernatant, og indflydelsen af specifikke FCR kan bestemmes ved hjælp af FCR-blokerende antistoffer, så ikke blot forskelle i fagocyterende styrken, der skal fastlægges, men downstream signalering arrangementer, med indsigt ind i mekanismen, og kan bidrage til at løse og forbedre forståelsen af denne immunologiske reaktion.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker at takke støtte fra NIH 3R01AI080289-02S1, og en Harvard University Center for AIDS Research Scholar Fellowship under NIH / NIAID 2P30AI060354-07.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit | Thermo Scientfic | 21935 |
|
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-50 membrane | Millipore | UFC905024 | Filter unit size may vary according to antigen size |
FluoSpheres NeutrAvidin labeled microspheres, 1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8776 | Manufacturers produce this product in various colors |
Melon Gel IgG Purification Kit | Thermo | 45212 | Care should be taken to verify the purity of Ab samples by SDS-page. |