رسم خرائط الانتشار الجزيئي في غشاء البلازما من قبل متعددة الهدف، للبحث عن المفقودين (MTT)

Summary

متعددة للبحث عن المفقودين الهدف هو خوارزمية محلية الصنع وضعت لتتبع الجزيئات بشكل فردي وصفت داخل الغشاء البلازمي للخلايا الحية. كشف بكفاءة، وتقدير وتعقب جزيئات مع مرور الوقت في كثافة عالية توفر سهل الاستعمال، وأداة شاملة للتحقيق في ديناميات غشاء النانو.

Abstract

هدفنا هو الحصول على وصف شامل لعمليات الجزيئية التي تحدث في الأغشية الخلوية في الوظائف البيولوجية المختلفة. ونحن نهدف إلى تحديد خصائص منظمة معقدة وديناميكية من غشاء البلازما في مستوى واحد جزيء، من خلال تطوير أدوات تحليلية واحدة مخصصة لتتبع الجسيمات (SPT) في كثافة عالية: الهدف متعددة للبحث عن المفقودين (MTT) ^1. واحدة جزيء videomicroscopy، وتقدم ميلي ثانية واحدة وقرار النانومترية ^1-11، يسمح لتمثيل مفصل لمنظمة غشاء ^12-14 بدقة عن طريق تعيين واصفات مثل مستقبلات الخلايا التوطين، والحبس، والتنقل أو التفاعلات.

نحن النظر SPT، على حد سواء بالتجربة وحسابيا. وشملت الجوانب التجريبية تحسين الإعداد ووسم الخلية، مع التركيز بشكل خاص على الوصول إلى كثافة العلامات أعلى مستوى ممكن، من أجل توفير لقطة الحيوية للديناميات الجزيئية 1ق يحدث داخل غشاء. المعنية بقضايا حسابي كل خطوة تستخدم لإعادة بناء مسارات: قمم الكشف، وتقدير وإعادة الاتصال، التي تناولتها وسائل محددة من تحليل الصور ^15،16. تنفيذ الانكماش بعد اكتشاف يسمح قمم انقاذ مخبأة في البداية من قبل القمم، أقوى المجاورة. من المذكرة، وتحسين الكشف يؤثر تأثيرا مباشرا لإعادة الاتصال، عن طريق تقليل الفجوات في المسارات. وقد تم تقييم العروض باستخدام مونتي كارلو محاكاة لكثافة العلامات المختلفة والقيم الضجيج، والتي تمثل عادة القيود الرئيسيتين لقياسات موازية في القرار المكانية العالية.

يمكن للدقة النانومترية ¹⁷ التي تم الحصول عليها عن الجزيئات واحدة، وذلك باستخدام إما المتعاقبة على / قبالة البصريات photoswitching أو غير الخطية، وتقديم الملاحظات شاملة. هذا هو أساس أساليب nanoscopy ¹⁷ مثل STORM ^{18، 19،20} النخيل، RESOLFT ²¹ أو STED ^22،23، مبادرة الخوذ البيضاءقد الفصل غالبا ما تتطلب عينات التصوير الثابت. المهمة المركزية هي الكشف وتقدير من الحيود محدودة القمم الصادرة عن جزيئات واحدة. وبالتالي، توفير افتراضات كافية مثل التعامل مع دقة ثابت الموضعية بدلا من الحركة البراونية، هي مناسبة بشكل مباشر MTT لتحاليل نانوية. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تستخدم أساسا MTT بأي مقياس: ليس فقط لجزيئات، ولكن أيضا لخلايا أو الحيوانات، وعلى سبيل المثال. وبالتالي، MTT هو خوارزمية تتبع القوية التي تجد تطبيقات في موازين الجزيئي والخلوي.

Protocol

في هذا الفيديو، نقدم كامل تتبع جسيم واحد تجربة، وذلك باستخدام الكم النقاط التي تستهدف مستقبلات غشاء محدد. والهدف الرئيسي من هذه التجربة تتمثل في أنواع مختلفة من السلوكيات التي تميز الانتشار الجزيئي تقاس داخل الغشاء البلازمي للخلايا الحية. في الواقع، يمكن للحركات ال…

Discussion

في واحدة تتبع الجسيمات، بجانب الجوانب الخلية والمجهري، وتحليل يمثل جزءا كبيرا من العمل. هذا ويتناول الخوارزمية المستخدمة لتنفيذ المهام الرئيسية الثلاث: كشف وتقدير وإعادة قمم فوق كل إطار. لكن الجانب يترتب على ذلك من هذا العمل تكمن في وضع الخوارزمية نفسها، والتي قد تح…

Materials

Reagent	Company	Catalogue number	Quantity
Cos-7 cell line	ATCC	CRL-1651	5,000 cells/well
HBSS without Ca2+	GIBCO	14175	1 ml
0.05% Trypsin EDTA	GIBCO	25300	1 ml
8-well Lab-tek	NUNC	155441	1
QDot-605 streptavidin	Invitrogen	Q10101MP	20 mM
Biotinylated Fab (for Fab synthesis, see reference 21)
Fab from mAb 108	ATCC	HB-9764	200 μg
NHS-Biotin	Thermo Scientific	21435	18.5 μg
Complete medium
DMEM	GIBCO	41965	500 ml
Fetal Bovine Serum	SIGMA	F7524	50 ml
L-Glutamine	GIBCO	25030	5 ml
HEPES	GIBCO	15630	5 ml
Sodium Pyruvate	GIBCO	11360	5 ml
Imaging medium
HBSS with Ca2+	GIBCO	14025	25 ml
HEPES	GIBCO	15630	250 μl

 

Equipment	Company	Reference
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TE2000U
Fluorescent lamp	Nikon	Intensilight C-HGFIE
1.3 NA 100x objective	Nikon	Plan Fluor 1.30
1.49 NA 100x objective	Nikon	APO TIRF 1.49
Camera	Roper Scientific	Cascade 512 B
Thermostated box	Life Imaging Services	The Box

Appendix: example Script of MTT supplementary analysis

function MTT_example(file_name)
%%% Basic examples showing how to recover MTT output results
%%% to plot each trace and to build the histogram
%%% of fluorescence intensities

if nargin<1 % no file_name provided?
    files = dir(‘*.stk’);
    if isempty(files), disp(‘no data in current dir’), return, end
    file_name = files(1).name; % default: first stk file
    disp([‘using’ file_name ‘by default’])
end

file_param = [file_name ‘_tab_param.dat’]; % output file

%% Load data
cd(‘output23′) % or (‘output22’), according to version used
% Disclaimer: version 2.2 only generates 7 parameters,
% an extra parameter, noise, was added in version 2.3

% To read all parameters at once, in a single table
% tab_param = fread_all_param(file_param);
% tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = …

% To read all parameters (except frame_number) in separate tables
% [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param);

tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % index is 3 because trace number & frame number, non informative, are discarded!
tab_j= fread_data_spt(file_param, 4);
tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5);
tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8);

%% Loop over traces
N_traces = size(tab_i,1);
% Tables are N_traces lines by N_frames colums

for itrc = 1:N_traces
    No_blk_index = tab_blk(itrc, :)>0; % non blinking steps only
     plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index))
    xlabel(‘i (pixel)’), ylabel(‘j (pixel)’)
    title([‘trace # ‘ num2str(itrc)])
    disp(‘Please strike any key for next trace’), pause
end

%% Fluo histogram
N_datapoints = sum(tab_blk(:)>0); % non blinking steps only
hist(tab_alpha(tab_blk>0),2*sqrt(N_datapoints)) % using 2sqrt(N) bins
xlabel(‘intensity (a.u.)’), ylabel(‘occurrence’)
title(‘histogram of particles fluorescence intensity’)