Kartläggning molekylär diffusion i plasmamembranet med Multiple-Target Tracing (MTT)

Summary

Flera Target Spårning är en hemmagjord algoritm som utvecklats för att spåra enskilda märkta molekyler inom plasmamembranet av levande celler. Effektivt upptäcka, bedöma och spårning molekyler över tid vid hög densitet ger en användarvänlig, heltäckande verktyg för att undersöka nanonivå membran dynamik.

Abstract

Vårt mål är att få en heltäckande beskrivning av molekylära processer som förekommer vid cellmembran i olika biologiska funktioner. Vi strävar efter att karakterisera den komplexa organisationen och dynamiken i plasmamembranet vid enda molekyl nivå, genom att utveckla analytiska verktyg avsedda för Single-Particle Tracking (SPT) med hög densitet: Multiple-Target Tracing (MTT) ^1. Enda molekyl videomikroskopi, som erbjuder millisekund och nanometrisk upplösning ^1-11, tillåter en detaljerad representation av membranet organisation ^12-14 genom noggrann kartläggning deskriptorer såsom cell-receptorer lokalisering, mobilitet, inneslutning eller interaktioner.

Vi revisited SPT, både experimentellt och algoritmiskt. Experimentella aspekter var bland annat att optimera inställningarna och cell märkning, med särskild tonvikt på att nå högsta möjliga märkning densitet, för att ge en dynamisk bild av molekylära dynamik enar den förekommer i membranet. Algoritmiska frågor som berörs varje steg för att återuppbygga banor: toppar upptäckt, uppskattning och återkoppling, som omfattas av särskild verktyg från bildanalys ^15,16. Implementera deflation efter detektering kan rädda toppar början döljas av intilliggande, starkare toppar. Att notera, att förbättra upptäckt direkt påverkar återanslutning, genom att minska klyftorna inom banor. Föreställningar har utvärderats med hjälp Monte-Carlo simuleringar för olika märkning densitet och värderingar buller, som vanligtvis representerar de två stora begränsningar för parallella mätningar med hög Spatiotemporal upplösning.

Den nanometrisk noggrannhet ¹⁷ erhållits för enstaka molekyler, antingen successiv on / off photoswitching eller icke-linjär optik, kan leverera uttömmande synpunkter. Detta är grunden för nanoscopy metoder ¹⁷ såsom STORMEN ^18, PALM ^19,20, RESOLFT ²¹ eller sted ^22,23, WHIch kan ofta kräver avbildning fasta prover. Den centrala uppgiften är att upptäcka och uppskattning av diffraktionsbegränsad toppar som härrör från enskilda molekyler. Därför tillhandahålla lämpliga antaganden om bland annat hantering av ett konstant lägesnoggrannhet i stället för Brownsk rörelse, är MTT rakt lämpad för nanoskopiska analyser. Dessutom kan MTT grunden användas på vilken skala som helst: inte bara för molekyler, men också för celler eller djur, till exempel. Därför är MTT en kraftfull spårning algoritm som hittar tillämpningar på molekylära och cellulära skalor.

Protocol

I den här filmen presenterar vi en fullständig enda experiment partikel spårning med hjälp av Quantum-punkter riktade till en specifik membranreceptor. Det främsta syftet med detta experiment består i diskriminerande olika typer av molekylär diffusion beteenden mäts i plasmamembranet av levande celler. I själva verket kan molekylära rörelser som uppstår på membranet avviker normalt från Brownsk diffusion genom att linjärt riktade eller begränsade inom nanodomains 26-29, till exempel. Vi sträv…

Discussion

I enkel-partikel spårning, bredvid cellen och mikroskopi aspekter utgör analysen en väsentlig del av arbetet. Detta tar den algoritm som används för att utföra de tre huvuduppgifter: att upptäcka, bedöma och återansluta topparna över varje bildruta. Men därmed del i detta arbete ligger i att utarbeta själva algoritmen, som kan behöva anpassas för en ny särskild utredning, främst för de sista, extra stegen (t.ex. dechiffrera former av rörelse, interaktioner eller stökiometri).

<p class="jove_conten…

Materials

Reagent	Company	Catalogue number	Quantity
Cos-7 cell line	ATCC	CRL-1651	5,000 cells/well
HBSS without Ca2+	GIBCO	14175	1 ml
0.05% Trypsin EDTA	GIBCO	25300	1 ml
8-well Lab-tek	NUNC	155441	1
QDot-605 streptavidin	Invitrogen	Q10101MP	20 mM
Biotinylated Fab (for Fab synthesis, see reference 21)
Fab from mAb 108	ATCC	HB-9764	200 μg
NHS-Biotin	Thermo Scientific	21435	18.5 μg
Complete medium
DMEM	GIBCO	41965	500 ml
Fetal Bovine Serum	SIGMA	F7524	50 ml
L-Glutamine	GIBCO	25030	5 ml
HEPES	GIBCO	15630	5 ml
Sodium Pyruvate	GIBCO	11360	5 ml
Imaging medium
HBSS with Ca2+	GIBCO	14025	25 ml
HEPES	GIBCO	15630	250 μl

 

Equipment	Company	Reference
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TE2000U
Fluorescent lamp	Nikon	Intensilight C-HGFIE
1.3 NA 100x objective	Nikon	Plan Fluor 1.30
1.49 NA 100x objective	Nikon	APO TIRF 1.49
Camera	Roper Scientific	Cascade 512 B
Thermostated box	Life Imaging Services	The Box

Appendix: example Script of MTT supplementary analysis

function MTT_example(file_name)
%%% Basic examples showing how to recover MTT output results
%%% to plot each trace and to build the histogram
%%% of fluorescence intensities

if nargin<1 % no file_name provided?
    files = dir(‘*.stk’);
    if isempty(files), disp(‘no data in current dir’), return, end
    file_name = files(1).name; % default: first stk file
    disp([‘using’ file_name ‘by default’])
end

file_param = [file_name ‘_tab_param.dat’]; % output file

%% Load data
cd(‘output23′) % or (‘output22’), according to version used
% Disclaimer: version 2.2 only generates 7 parameters,
% an extra parameter, noise, was added in version 2.3

% To read all parameters at once, in a single table
% tab_param = fread_all_param(file_param);
% tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = …

% To read all parameters (except frame_number) in separate tables
% [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param);

tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % index is 3 because trace number & frame number, non informative, are discarded!
tab_j= fread_data_spt(file_param, 4);
tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5);
tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8);

%% Loop over traces
N_traces = size(tab_i,1);
% Tables are N_traces lines by N_frames colums

for itrc = 1:N_traces
    No_blk_index = tab_blk(itrc, :)>0; % non blinking steps only
     plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index))
    xlabel(‘i (pixel)’), ylabel(‘j (pixel)’)
    title([‘trace # ‘ num2str(itrc)])
    disp(‘Please strike any key for next trace’), pause
end

%% Fluo histogram
N_datapoints = sum(tab_blk(:)>0); % non blinking steps only
hist(tab_alpha(tab_blk>0),2*sqrt(N_datapoints)) % using 2sqrt(N) bins
xlabel(‘intensity (a.u.)’), ylabel(‘occurrence’)
title(‘histogram of particles fluorescence intensity’)