成功地利用MALDI – TOF质谱监察PAK2活化蛋白激酶的酰胺氢/氘交换。
酰胺氢/氘交换质谱(H / D交换)已被广泛用于分析蛋白质 – 蛋白质相互作用,蛋白质构象变化,蛋白质动力学,蛋白质 – 配体相互作用的接口。 H / D交换骨干酰胺的位置已经被用来测量质谱 1,2,3中的一种蛋白质的微区的氘率。这种方法的分辨率取决于利益氘蛋白的胃蛋白酶消化成肽,通常范围从3-20残留。虽然H / D交换质谱测量的分辨率比单残留的异核单量子相干(HSQC)核磁共振,在H / D交换的质谱测量方法测量的分辨率较低的大小并不局限于蛋白4。 H / D交换是在水溶液中,维持蛋白质构象进行了。我们提供了一种方法,UTILizes 2检测的MALDI – TOF,而不是一个HPLC / ESI(电喷雾电离) – MS系统5,6。 MALDI – TOF提供消化的蛋白质肽的精确质量强度数据,在这种情况下蛋白激酶PAK2(也称为γ-白)。蛋白水解白2进行脱机胃蛋白酶的消化。这另一种方法,当用户不具有访问一个连接到质谱高效液相色谱法和胃蛋白酶列,或当HPLC法测定胃蛋白酶列不会导致在一个最佳的消化地图,例如,大量二硫化物保税分泌型磷脂酶A 2 (SPLA 2)。利用这种方法,我们成功地监测在PAK2激活caspase 3的裂解和自身磷酸化7,8,9氘水平的变化。
胃蛋白酶消化片段的鉴定是关键的一步,H / D交换实验。不正确识别的肽,会导致错误的结论。胃蛋白酶消化PAK2是通过反相高效液相色谱C18柱洗脱获得一个干净的背景。在我们的实验中,共收集了40分数和遭受的MALDI – TOF。多肽,可确定每个分数。肽串联质谱(Q – TOF MS / MS和oMALDI的MS / MS),以确定它们的DNA序列。肽的MS / MS谱图应至少有三个产品离子,以确认鉴定肽。
数据浏览器4.0的计算机程序(Applied Biosystems公司)执行初始基线校正和噪声过滤。必须校准每个频谱基于两个测序峰。我们我们的频谱校正理论质量的undeuterated m / z为923.45和1697.84。 T他质量校准后的精度可以达到10 PPM。单同位素氘后,可能会转移到一个更高的质量。单一步骤增加这些m / z为比值取得与氘增强人民群众。群众信封峰强度不会影响氘水平。然而,在一个特定的质量信封同位素峰的峰强度计算的平均质量的关键。纳入氘核的计算的第一步是从氘样品的非氘样品减去肽质量。其他因素,D 2 O稀释,侧链和背面的交流中残留的氘核,将需要进一步考虑计算( 图1) 。 D 2 O稀释,混合后的样品和 D 2 O缓冲区启动H / D 交换 ,D 2 O稀释倍数。胃蛋白酶消化的侧链残留氘核(4.5%)版多肽需要减去。背面交换氘氘和胃蛋白酶消化肽质量测量过程中的所有不可避免的损失。
最溶剂的访问后24小时H / D交换肽(M / Z = 1105.60),代表了全氘地区。每个肽纳入氘核的氘和氘非PAK2消化性溃疡肽的质心之间的差异。最高度氘肽的m / z 1105代表全氘PAK2 24小时的H / D交换时。回到外汇比率计算实际纳入氘核H / D交换肽在m / z为1105的所有可能的交换网站分为24小时。
The authors have nothing to disclose.
支持这项工作是由国家卫生部批准GM – 26738研究院(翟)的一部分。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
D2O | Aldrich | 7789-20-0 | |
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | 28166-41-8 | |
MALDI-TOF | PE Biosystems | Voyager DE STR | |
Q-TOF mass spectrometer | Q-TOF Ultima-Global | ||
QSTAR XL oMALDI MS/MS | Applied Biosystems | ||
Data Explorer 4.0 computer program | Applied Biosystems |