Um método para condicionalmente knockdown expressão de uma proteína alvo na retina zebrafish adulto é descrito, que envolve a injeção intravítrea injeção morpholinos antisense e electroporating-los na retina. A proteína resultante é derrubado por vários dias, o que permite testar o papel da proteína na regeneração ou retina intacta.
Muitos devastadoras doenças oculares hereditárias resultar em cegueira progressiva e irreversível, porque os seres humanos não podem se regenerar morrendo ou doentes neurônios da retina. Em contraste, a retina zebrafish adulto possui a capacidade robusta de espontaneamente regenerar qualquer classe neuronal que se perde em uma variedade de diferentes modelos de danos na retina, incluindo punção da retina, a ablação química, alta temperatura concentrada, e tratamento luz intensa 1-8. Nosso laboratório amplamente caracterizada a regeneração de fotorreceptores após o tratamento luz constante intensa e interior neurônios da retina após injeção intravítrea ouabaína 2, 5, 9. Em todos os casos, residente glia Müller re-entrar no ciclo celular para a produção de progenitores neuronais, que continuam a proliferar e migrar para a camada adequada da retina, onde se diferenciam em neurônios deficiente.
Nós caracterizada cinco estágios diferentes durante a regeneração da dama-luzged retina que foram destacados por respostas específicas celular. Foram identificados vários genes diferencialmente expressos em cada estágio de regeneração da retina através da análise mRNA microarray 10. Muitos destes genes também são críticos para o desenvolvimento ocular. Para testar o papel de cada gene candidato / proteína durante a regeneração da retina, precisávamos desenvolver um método para condicionalmente limitar a expressão de uma proteína único candidato, por vezes, durante a regeneração da retina adulta.
Oligos morfolino são amplamente utilizados para estudar a perda da função de proteínas específicas durante o desenvolvimento do peixe-zebra, Xenopus, pinto, mouse e tumores em xenoenxertos humanos 11-14. Estes pares de bases modificadas oligos com seqüência de RNA complementar, quer bloquear a emenda ou a tradução do RNA alvo. Morpholinos são estáveis na célula e pode eliminar ou "knockdown" a expressão da proteína por três a cinco dias 12.
Aqui,nós descrevemos um método eficiente para a expressão da proteína knockdown alvo na retina zebrafish adulto. Este método emprega lisamina marcadas morpholinos antisense que são injetadas no vítreo do olho zebrafish adulto. Utilizando uma pinça eletrodo, o morfolino é então electroporated em todos os tipos de células da retina dorsal e central. Lissamina fornece a carga na morfolino para eletroporação e podem ser visualizados para avaliar a presença do morfolino nas células da retina.
Knockdown condicional na retina pode ser usado para examinar o papel de proteínas específicas em momentos diferentes durante a regeneração. Além disso, esta abordagem pode ser usada para estudar o papel de proteínas específicas na retina não danificada, em processos como a transdução visual e processamento visual em neurônios de segunda ordem.
Recentemente, duas análises microarray examinou as mudanças de expressão gênica que ocorreu durante a regeneração de qualquer retina a luz danificado ou um patch cirurgicamente extirpado da retina 10, 16. Ambos os estudos revelaram numerosos genes que apresentaram mudanças significativas na expressão, seja crescente ou decrescente, que provavelmente são necessários para diferentes eventos que ocorrem durante a regeneração da retina, como a re-entrada da glia Müller no ciclo celular, proliferação e migração contínua do progenitores neuronais para a camada da retina danificada, ea diferenciação dos progenitores neuronais para o tipo de célula neuronal correta. Embora uma comparação direta desses dois conjuntos de dados microarray revelam genes candidatos que possam estar envolvidos nestes eventos celulares, em última instância esses genes e suas proteínas codificadas devem ser testados para determinar se eles são necessários para a regeneração neuronal. Aqui, descrevemos uma abordagem de perda de função-poderoso a conditionalmente knockdown proteínas de interesse na retina zebrafish adulto. Esta técnica tem sido usada para estudar ambas as proteínas extracelular e intracelular, bem como moléculas sinalizadoras, fatores de transcrição e proteínas necessárias para a replicação de DNA 17-19. Assim, este método tem ajudado muito a nossa compreensão do mecanismo molecular subjacente a regeneração da retina adulta em zebrafish.
Testamos vários parâmetros eletroporação (número de tensão, de pulsos, o tempo entre os pulsos) antes de um protocolo bem sucedido foi alcançado. Um relatório anterior do electroporating morpholinos no fin regeneração caudal zebrafish utilizado 10 pulsos em uma baixa voltagem (15 V) 20. Porque a retina zebrafish adulto é rodeado por várias camadas de células e não é facilmente acessível a eletrodos pinça, os parâmetros utilizados na fin foram fracassadas de forma eficiente electroporating morpholinos na retina adulta. Por outro lado, uma alta voltagem (100 V), muitas vezes resulted na morte do peixe. Recentemente, 5 pulsos de 80 V foi descrito electroporate DNA plasmídeo na retina do rato recém-nascido filhote 21. Descobrimos que um pouco menos intensa 2 pulsos de 75 V resultou em eletroporação bem-sucedida do morpholinos na retina zebrafish adulto com a sobrevivência de 100% dos peixes tratados. Além disso, descobrimos que a remoção da maioria do exterior (ou externo-mais) componente da córnea aumentou muito a eficiência eletroporação. Aumentar o número de pulsos pode eliminar a necessidade de remoção deste tecido, mas também pode causar danos maiores tecido. Estudos de controle extensa demonstrou que estes parâmetros não causou morte celular significativa da retina ou alterar as respostas celulares específicas observadas durante a regeneração de fotorreceptores 19. Ganho de função de estudos não são atualmente possíveis usando esta técnica in vivo, devido à nossa incapacidade de forma consistente electroporate grandes ácidos ribonucléico em todos os retinal células. No entanto, o sucesso de electroporating plasmídeos na retina do rato in vivo e da retina zebrafish em explantes sugere ainda é uma possibilidade em zebrafish 21, 22.
Um dos pontos fortes desta técnica é a eletroporação parece eficiente introduzir o morfolino em todos os diferentes tipos de células da retina. No entanto, uma potencial fraqueza era que a eletroporação eficiente entregou o morfolino apenas nas regiões dorsal e central da retina. Um evento de eletroporação segunda para a metade ventral dos resultados retina no alvo bom para todas as camadas, mas muitas vezes resulta em danos. Esta restrição espacial foi provavelmente devido à forma e posicionamento dos eletrodos. O uso de eletrodos de design personalizado em forma de taça que poderia ser colocado ao redor do olho pode melhorar esta fraqueza. Esta restrição espacial da entrega morfolino limita o uso desta técnica e impede o uso de um ensaio de sucessoh como a análise ERG que exigiria uma avaliação global da retina. Deve-se notar que como em qualquer experimento morfolino, é aconselhável para confirmar seus resultados usando um segundo, não se sobrepõem morfolino ao mRNA alvo. Em alguns casos, é possível também electroporate dois morpholinos diferentes simultaneamente para knockdown da expressão de duas proteínas diferentes. Demonstramos isso derrubando a expressão de ambos os Pax6a e proteínas Pax6b, individualmente e em associação 18.
Embora tenhamos demonstrado o uso desta técnica com o nosso modelo de danos luz, poderia provavelmente ser usado para estudar a regeneração em modelos de outros danos 2-8 ou usado para examinar a função das proteínas na retina não danificada. Por exemplo, eletroporação de morpholinos poderia ser usado para knockdown da expressão de canais específicos ou moléculas de transdução de sinal no gânglio ou células amácrinas e depois estudar a função desses sinalizaçãocaminhos no processamento visual. No entanto, como morpholinos só afetam tradução da nova proteína, a pessoa teria que esperar até turnover de proteína endógena ocorre antes de um ensaio pode ser realizado. Em função da estabilidade da proteína, que pode variar de horas a dias 18.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer à Vida Freimann Science Center e Center for Research Zebrafish pessoal para seu cuidado e manutenção do peixe-zebra.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
CUY21-EDIT or CUY21-SC Square wave electroporator | Protech International | CUY21EDIT or CUY21SC | Both units work for this protocol |
3-mm diameter paddle electrodes | Protech International | CUY 650-P3 | |
Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
2-Phenoxyethanol | Sigma | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments | 14095 | Any #5 tweezers with work |
Dumont #5B tweezers with angled tips | World Precision Instruments | 500234 | Used to enucleate eye following euthanasia |
Sapphire blade, double edge lance, 1 mm wide, with Sapphire knife handle | World Precision Instruments | Blade: 500314 Handle: 500317 |
|
Hamilton syringe with removable 33 gauge blunt-end needle | Hamilton company | Syringe: 87930 Needle: 7762-06 |
Remove needle that comes with syringe and replace with 33-gauge blunt-end needle |