Anvendelse av MassSQUIRM for kvantitative målinger av Lysine demethylase aktivitet
Summary
Vi presenterer en metode for å bruke MALDI massespektrometri og reduktive metylering kjemi å kvantifisere endringer i lysin metylering.
Abstract
Nylig har epigenetic regulatorer blitt oppdaget som sentrale aktører i mange ulike sykdommer 1-3. Som et resultat av disse enzymene er førsteklasses mål for lite molekyl studier og legemiddelutvikling 4. Mange epigenetic regulatorer har bare nylig blitt oppdaget og er fortsatt i ferd med å bli klassifisert. Blant disse enzymene er lysin demethylases som fjerner metylgrupper fra lysines på histoner og andre proteiner. På grunn av romanen karakter av denne klassen enzymer, er det få analyser er utviklet for å studere deres aktivitet. Dette har vært en veisperring til både klassifisering og høy gjennomstrømning studie av histone demethylases. Foreløpig svært få demethylase analyser foreligger. De som gjør eksisterer tendens til å være kvalitativ i naturen og kan ikke samtidig skjelne mellom de forskjellige lysin metylering tilstander (un-, mono-, di-og tri-). Massespektrometri er vanlig å bestemme demethylase aktivitet men dagens massespektrometrisk analyser doikke ta om differensielt denaturert peptider ionisere annerledes. Differensiert ionisering av denaturert peptider gjør sammenligne metylering stater vanskelig og slett ikke kvantitativ (figur 1A). Dermed tilgjengelige analysene ikke er optimalisert for omfattende analyse av demethylase aktivitet.
Her beskriver vi en metode som kalles MassSQUIRM (massespektrometrisk kvantifisering ved hjelp av isotoper reduktive metylering) som er basert på reduktive metylering av aminer grupper med deuterert formaldehyd å tvinge alle lysines å være di-denaturert, og dermed gjør dem i hovedsak de samme kjemiske stoffer og derfor ionisere samme (Figur 1B). Den eneste kjemiske forskjellen etter reduktiv metylering er hydrogen og deuterium, som ikke påvirker MALDI ionisering effektivitet. Den MassSQUIRM analysen er spesifikk for demethylase reaksjonsprodukter med un-, mono-eller di-denaturert lysines. Analysen er også aktuelt å lysin methyltransferases gir SAmeg reaksjonsprodukter. Her bruker vi en kombinasjon av reduktiv metylering kjemi og MALDI massespektrometri å måle aktiviteten til LSD1, en lysin demethylase stand til å fjerne di-og mono-metylgrupper, på en syntetisk peptid substrat 5. Denne analysen er enkel og lett mottakelig for noen lab med tilgang til en MALDI massespektrometer i laboratoriet eller gjennom en proteomikk anlegget. Analysen har ~ 8-fold dynamisk rekkevidde og er lett skalerbar til plate-format fem.
Protocol
Discussion
MassSQUIRM er en billig og kvantitativ metode for helhetlig analyse av aktiviteten til lysin demethylases involvert i mono-og di-metylering. MassSQUIRM tilbyr kvantifisering ikke bare av produktet av reaksjonen, men også for mellomprodukter. Denne analysen kan brukes som et kraftig verktøy i å studere mekanismen av LSD1 og andre histone demethylases. Det vil også være nyttig for å klassifisere mange nyoppdagede lysin demethylase enzymer som PHF8 og kan brukes til visse metyltransferase enzymer.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker UAMS Proteomikk Facility for massespektrometrisk støtte. Midler til dette prosjektet ble gitt av NIH tilskudd P20RR015569, P20RR016460 og R01DA025755.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| LSD1 | BPS Biosciences | 50100 |
| H3K4me2-biotin peptide | prepared in-house | none |
| POROS R2 20 micron beads | Applied Biosystems | 1-1129-06 |
| C18 ZipTip | Millipore | ZTC18M |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 |
| acetonitrile | Fisher | A996 |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma | 85707 |
| Borane dimethylamine | Sigma | 180238 |
| isotopically heavy d2-formaldehyde | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-805-20 |
| Tris | Fisher | BP154 |
| KCl | Fisher | BP366 |
| MgCl2 | Fisher | BP214 |
| Glycerol | Fisher | G33 |
| Formic acid | Fluka | 06440 |
| Methanol | Fisher | A452 |
| Na-phosphate | Fisher | BP329 |
| SpeedVac Concentrator | Savant | DNA110 |
| MALDI-prOTOF mass spectrometer and TOFworks software | PerkinElmerSciex | none |
Referências
- Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. Epigenetics: a landscape takes shape. Cell. 128, 635-638 (2007).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer. Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).
- Cole, P. A. Chemical probes for histone-modifying enzymes. Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119, 941-953 (2004).
- Blair, L. P. MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity. Epigenetics. 6, 490-499 (2011).
- Rayment, I. Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor. Science. 261, 50-508 (1993).
- Collom, S. L., Jamakhandi, A. P., Tackett, A. J., Radominska-Pandya, A., Miller, G. P. CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling. Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).
- Gradolatto, A. Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression. Genética. 179, 291-304 (2008).
- Taverna, S. D. Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs. Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).
