Tillämpning av MassSQUIRM om kvantitativa mätningar av Lysin demetylas aktivitet
Summary
Vi presenterar en metod för användning av MALDI masspektrometri och reduktiv metylering kemi för att kvantifiera förändringar i lysin-metylering.
Abstract
Nyligen har epigenetiska regulatorer upptäckts som viktiga aktörer i många olika sjukdomar 1-3. Som ett resultat av dessa enzymer är viktiga mål för små molekyler studier och utveckling av läkemedel 4. Många epigenetiska regulatorer har endast nyligen upptäckts och är fortfarande i färd med klassificeras. Bland dessa enzymer är lysin demethylases som avlägsnar metylgrupper från lysiner på histoner och andra proteiner. På grund av den nya typen av denna klass av enzymer, har få analyser har utvecklats för att studera deras aktivitet. Detta har varit en vägspärr till både klassificering och hög kapacitet studie av histon demethylases. För närvarande mycket få demetylas analyser finns. De som finns tenderar att vara av kvalitativ art och kan inte samtidigt urskilja mellan de olika lysin metylering stater (FN, mono-, di-och tri-). Masspektrometri används ofta för att bestämma demetylas aktivitet men nuvarande masspektrometriska analyser görinte upp om differentiell metylerade peptider jonisera annorlunda. Differential jonisering av metylerade peptider som gör en jämförelse metylering stater svårt och definitivt inte kvantitativt (Figur 1A). Således finns analyserna inte är optimerade för den omfattande analysen av demetylas aktivitet.
Här beskriver vi en metod som kallas MassSQUIRM (masspektrometrisk kvantifiering med användning av isotopiskt reduktiv metylering) som är baserad på reduktiv metylering av amingrupper med deutererad formaldehyd för att tvinga alla lysiner vara di-metylerad, vilket sålunda gör dem väsentligen samma kemiska arter och därför jonisera samma (figur 1B). Den enda kemiska skillnaden efter reduktiv metylering är väte och deuterium, som inte påverkar MALDI jonisering effektivitet. Den MassSQUIRM Analysen är specifik för demetylas reaktionsprodukter med FN-, mono-eller di-metylerade lysiner. Analysen är också tillämplig på lysin metyltransferaser som ger SAmig reaktionsprodukter. Här använder vi en kombination av reduktiv metylering kemi och MALDI masspektrometri för att mäta aktiviteten av LSD1, en lysin demetylas förmåga att avlägsna di-och mono-metylgrupper, på ett syntetiskt peptidsubstrat 5. Denna analys är enkel och lätt tillgängliga för varje laboratorium med tillgång till ett MALDI masspektrometer i laboratoriet eller genom en proteomik anläggning. Analysen har ~ 8-faldig dynamiskt omfång och är lätt skalbar för att plattformat 5.
Protocol
Discussion
MassSQUIRM är en billig och kvantitativ metod för heltäckande analys av aktiviteten av lysin demethylases involverade i mono-och di-metylering. MassSQUIRM erbjuder kvantifiering inte bara av produkten av reaktionen, utan även för mellanprodukterna. Denna analys kan användas som ett kraftfullt verktyg för att studera mekanismen för LSD1 och andra histon demethylases. Det kommer också att vara användbara för att klassificera många nyligen upptäckta lysin demetylas enzymer såsom PHF8 och skulle kunna använda…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar UAMS Proteomics faciliteten för masspektrometrisk stöd. Finansieringen för detta projekt har tillhandahållits av NIH bidrag P20RR015569, P20RR016460 och R01DA025755.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| LSD1 | BPS Biosciences | 50100 |
| H3K4me2-biotin peptide | prepared in-house | none |
| POROS R2 20 micron beads | Applied Biosystems | 1-1129-06 |
| C18 ZipTip | Millipore | ZTC18M |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 |
| acetonitrile | Fisher | A996 |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma | 85707 |
| Borane dimethylamine | Sigma | 180238 |
| isotopically heavy d2-formaldehyde | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-805-20 |
| Tris | Fisher | BP154 |
| KCl | Fisher | BP366 |
| MgCl2 | Fisher | BP214 |
| Glycerol | Fisher | G33 |
| Formic acid | Fluka | 06440 |
| Methanol | Fisher | A452 |
| Na-phosphate | Fisher | BP329 |
| SpeedVac Concentrator | Savant | DNA110 |
| MALDI-prOTOF mass spectrometer and TOFworks software | PerkinElmerSciex | none |
Referências
- Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. Epigenetics: a landscape takes shape. Cell. 128, 635-638 (2007).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer. Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).
- Cole, P. A. Chemical probes for histone-modifying enzymes. Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119, 941-953 (2004).
- Blair, L. P. MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity. Epigenetics. 6, 490-499 (2011).
- Rayment, I. Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor. Science. 261, 50-508 (1993).
- Collom, S. L., Jamakhandi, A. P., Tackett, A. J., Radominska-Pandya, A., Miller, G. P. CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling. Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).
- Gradolatto, A. Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression. Genética. 179, 291-304 (2008).
- Taverna, S. D. Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs. Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).
