전체 마운트 근육 분석에 의한 재현성 마우스 좌골 신경 크러시와 중생의 후속 평가
Summary
이 보고서에서는 마우스 좌골 신경을 파멸시키는 방법을 설명합니다. 이 방법은 쉽게 사용할 수 hemostatic 집게를 사용하여 쉽고 reproducibly 전체 좌골 신경 호감을 생산하고 있습니다. 또한 좌골 신경 호감 후 신경 재생의 분석에 적합한 근육 전체가 마운트를 준비하는 방법을 설명합니다.
Abstract
말초 신경계 (PNS)의 중생은 널리 인간의 질병에 그것의 관련성을함으로써 가능한 CNS 재생 1의 실패를 계몽 PNS의 뉴런에 의해 탑재된 강력한 재생 반응을 이해하는 모두 공부하고 있습니다. 좌골 신경 호감 (axonotmesis)는 설치류 2 말초 신경 손상의 가장 일반적인 모델 중 하나입니다. 그 중생은 3,4 최적 수 있도록 인터럽트에게 반해 모든 axons하지만 Schwann 세포 기저 laminae는 보존됩니다. 이 조사가 정확하게 Schwann 세포 및 기저 laminae 사 모두와 상호 작용하는 성장 축삭의 능력을 공부하실 수 있습니다. 쥐 실험은 일반적으로 신경 호감을 위해 선호하는 동물 모델되었습니다. 그들은 널리 사용할 수 있으며 자신의 lesioned 좌골 신경은 인간의 신경 병변 5,4의 합리적인 근사치를 제공합니다. 쥐의 신경보다 크기가 작은 있지만, 마우스 신경은 많은 유사한 자질을 가지고 있습니다. 가장 중요한 것은 그래도 mous전자 모델 때문에 유전자 변형 라인의 넓은 가용성을 증가 가치는 이제 신경 재생 6, 7에 대한 중요한 개별 분자의 상세한 해부을 허용합니다. 이전 수사관은 단순 직각 포셉, 냉장 포셉, hemostatic 포셉, 혈관 클램프, 그리고 탐정 설계 클램프 8,9,10,11,12 포함한 신경 호감이나 부상을 생산하기 위해 여러 방법을 동원했습니다. 수사관은 또한 봉합, 탄소 입자와 형광 구슬 13,14,1 포함한 부상 사이트를 표시하는 다양한 방법을 동원했습니다. 우리는 정확하고 영구가 좋은 hemostatic 포셉 및 마킹 이후 탄소 호감이 사이트를 방문하여 호감이 사이트의 마킹으로 reproducibly 전체 좌골 신경 호감을 얻는 우리의 방법을 설명합니다. 좌골 신경 호감 절차의 설명의 일환으로 우리는 또한 근육 전체의 비교적 간단한 방법을 포함하는 것은 우리가 이후에 재생을 계량하는 데 사용할 탑재합니다.
Protocol
Discussion
우리는 호감이 사이트의 정확한 마킹과 함께 안정적으로 완전한 좌골 신경 호감을 얻을 수있는 방법을 제시했습니다. 이전에 언급했듯이, 좌골 신경 호감은 마우스 및 쥐의 말초 신경 손상의 일반적인 모델입니다. 호감의 각 방법의 장점과 단점을 가지고 있지만, 우리는이 방법을 쉽게 특수 장비 (예 : 특수 클램프 등)을 최소로 표시되었다 완전한 호감을 생산 발견.
호감 방법 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 또한 NIH 교부금 K08NS065157 (TAF까지)에 의해 지원되었다 Musculoskeletal 장애에 대한 펜은 센터, 관절염의 국립 연구소에서 보너스 번호 P30AR050950는 Musculoskeletal와 피부 질환이 작품을 (TAF와 스티븐 S. Scherer) 지원. 마지막으로, Shriners 소아 연구 센터 종자 기금 (TAF)이 작업을 지원합니다. 우리는 처음에는 그림 1의 스케치를 생산하는 그녀의 도움을 전체 장착 절차와 에이미 A. 김 시연을 위해 박사 영 진의 아들을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| Mini Clipper with No. 0000 Blade | Roboz | RC-5903 |
| Nair Hair Remover (9 oz.) | Church and Dwight Co., Inc. | N/A |
| Betadine Surgical Scrub (1 gallon) | Fisher Scientific | 19066452 |
| Ophthalmic Ointment (1 oz.) | Fisher Scientific | 19082795 |
Surgical Tools:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| FST 250 Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 |
| Iris Scissors (11 cm long) | World Precision Instruments | 500216 |
| Potts-Smith Forceps (Straight; 18cm; 1×2 Teeth) | Fine Science Tools | 11024-18 |
| McPherson-Vannas Scissors (5 mm blades) | World Precision Instruments | 14124-G |
| Dumont #5 Forceps – Dumoxel Standard Tip | Fine Science Tools | 11252-30 |
| Dumont #5/45 Forceps – Dumoxel Standard Tip | Fine Science Tools | 11251-35 |
| Ultra Fine Hemostats (Straight; Smooth Inside Surfaces) | Fine Science Tools | 13020-12 |
| Powdered Activated Carbon (500 g) | Fisher Scientific | C272-500 |
| Size 6-0 Sutures with C-1 Needle (Sterile, Silk, Black, Braided , Non-absorbable; 18” Length; Box of 36) | Roboz | SUT-1073-11 |
| Reflex Clip Applier (for 9 mm clips) | World Precision Instruments | 500345 |
| 9mm Stainless Steel Reflex Clips (100/box) | World Precision Instruments | 500346 |
Animal Care:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| 0.9% Sodium Chloride Injection (Preservative Free; 20 mL) | Hospira | 0409-4888-20 |
| Complete Homeothermic Blanket System with Flexible Probe (Medium, 115 VAC, 60 Hz) | Harvard Apparatus | 507222F |
Surgical Platform and Retractors:
(purchased at local hardware store)
| Name (description/) | Quantity |
| Stainless Steel Platform (Milled; ~12”x12”x1/8”) | 1 |
| Button Magnets (Example: Eclipse E825) | 3 |
| Stainless Steel Bolts (3” Long; Diameter Determined by Button Magnets) | 3 |
| Stainless Steel Nuts (Sized to Fit Bolts) | 9 |
| Rubber Bands (Light Tension) | 3 |
| Insect Pins (Both Ends Bent to Form Hooks) | 3 |
Semi-Thins:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| Paraformaldehyde (1 kg) | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (500 g; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | S375-500 |
| Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous (1 kg; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | AC38987-0010 |
| Glutaraldehyde (50%; 10 x 10 mL) | Ted Pella, Inc. | 18431 |
| Osmium Tetroxide (4% Aqueous, 10 x 10 mL) | Ted Pella, Inc. | 18465 |
| Propylene Oxide (450 mL) | Ted Pella, Inc. | 18601 |
| Embed 812 (Kit, for hard blocks/high image contrast) | Electron Microscopy Sciences | 14120 |
| Toluidine Blue (25 g) | Ted Pella, Inc. | 19451 |
Whole Mount Muscle Preparation and Immunohistochemistry:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| Paraformaldehyde (1 kg) | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (500 g; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | S375-500 |
| Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous (1 kg; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | AC38987-0010 |
| 10% BSA Diluent/Blocking Solution (200 mL) | Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. | 50-61-00 |
| Triton X-100 (100 mL) | Dot Scientific Incorporated | 9002-93-1 |
| Glycine, 98% (1 kg) | Fisher Scientific | AC12007-0010 |
| Tissue-Tek Cryo-OCT Compound (Case of 12; 4 oz bottles) | Fisher Scientific | 14-373-65 |
| Sylgard DOW 170 (2 lb. Kit) | Fisher Scientific | NC9492579 |
| Stainless Steel Insect Pins, Size 1 (100/pkg) | Fine Science Tools | 26001-40 |
| Tetramethylrhodamine-A-Bungarotoxin (0.5 mg) | Sigma-Aldrich | T0195-.5MG |
| Mouse Monoclonal Antibody Against SMI-312 (0.1 mL) | Covance | SMI-312R |
| Mouse Monoclonal Antibody Against SV2 (0.1 mL) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | SV2 |
| Rabbit Polyclonal Antibody Against GAP-43 | Novus Biologicals | NB300-143 |
| Flourescein Conjugated Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ Subclass 1 Specific | Jackson ImmunoResearch | 115-095-205 |
| DyLight 649 Conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-495-152 |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, dilactate; 10 mg) | Invitrogen | D3571 |
| Vectashield Mounting Medium (10 mL) | Vector Laboratories | H-1000 |
| Superfrost Plus Microscope Slides (White; Size: 75 x 25 mm; Pack of 144) | Fisher Scientific | 12-550-15 |
| Fisherfinest Premium Cover Glasses (Size: 40 x 22 mm; Pack of 1 oz.) | Fisher Scientific | 12-548-5C |
Referências
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