ホールマウントマッスル分析による再現性のあるマウスの坐骨神経クラッシュと再生のその後の評価
Summary
本報告では、マウス坐骨神経を粉砕する方法を説明します。このメソッドは、容易に利用可能な止血鉗子を使用して、簡単かつ再現性を完全に坐骨神経のときめきを生成します。さらに、坐骨神経挫滅後の神経再生の解析に適した筋肉全体のマウントを準備する方法について説明します。
Abstract
末梢神経系（PNS）の再生が広く、両方のヒトの疾患との関連性について検討されており、それによっておそらくCNS再生1の障害を照らすPNSニューロンによってマウントされた堅牢な回生応答を理解する。坐骨神経のときめき（軸索断裂）は、げっ歯類の2の末梢神経損傷の最も一般的なモデルの一つです。その再生が3,4に最適ですので、破砕の割り込みはすべての軸索がシュワン細胞基底層は保持されます。これは研究者が正確にシュワン細胞と基底層4の両方と相互作用する軸索成長の能力を研究することができます。ラットは、一般的に実験的な神経の粉砕のための好ましい動物モデルをされている。彼らは広く入手可能であり、その病変坐骨神経は、ヒトの神経病変5,4の合理的な近似値を提供しています。ラットの神経よりもサイズが小さくても、マウスの神経は、多くの類似した性質を持っています。最も重要なのはしかし、覚書Eモデルがあるためトランスジェニック系統の幅広い可用性、ますます貴重なものになりまし神経再生6、7の重要な個々の分子の詳細な解剖を可能にします。前の調査官は、単純な直角鉗子、チルド鉗子、止血鉗子、血管クランプ、および治験責任医師に設計されたクランプ8,9,10,11,12含む神経クラッシュやけがを生成するために複数のメソッドを使用しています。捜査官はまた、縫合糸、炭素粒子と蛍光ビーズ13,14,1含む損傷部位のマーキングの様々な方法を使用しています。我々は、クラッシュサイトのマーキングを正確かつ永続的な細かい止血鉗子とそれに続く炭素ときめきサイトマーキングを使用して再現性を完全に坐骨神経のときめきを得るための手法を説明します。坐骨神経挫滅手順の我々の記述の一部として、我々はまた我々はその後再生を定量化するために使用するマウント筋肉全体の比較的単純な方法が含まれている。
Protocol
1。動物の科目 1.1。治療すべての動物の手順は、痛みや不快感を最小限に抑えるためにとられた措置で、地元の金融機関の動物のケアと倫理委員会の承認を得て衛生ガイドラインの使用と委員会と国立研究所に従って実行する必要があります。 私たちのマウスは、給餌マウス飼料および水を自由に摂取しながら、12時間逆明暗サイクルで温度制御された条件?…
Discussion
我々は、クラッシュサイトの正確なマーキングを確実に完全に坐骨神経のときめきを取得する方法を提案した。前述のように、坐骨神経のときめきは、マウスとラットの末梢神経損傷の一般的なモデルです。ときめきの各メソッドは、その長所と短所がありますが、我々は、このメソッドは、簡単に特殊な装置（例えば特殊なクランプ、等）の最小値でマークされた完全なクラッシュを作り?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、関節リウマチの国立研究所からの筋骨格系疾患のためのペンセンター、賞の数P30AR050950さらに、NIHの助成金K08NS065157（TAFまで）によってサポートされていました、筋骨格系と皮膚疾患は、（TAFとSteven S.シェーラー）この作業をサポートしていました。最後に、シュライナーズ小児研究センターのシード資金（TAF）は、この作業をサポートしていました。私たちは、最初に図1のスケッチを製造する彼女の援助全体のマウント手順とエイミーA.キムを示すために博士·ヨンジンの息子に感謝します。
Materials
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| Mini Clipper with No. 0000 Blade | Roboz | RC-5903 |
| Nair Hair Remover (9 oz.) | Church and Dwight Co., Inc. | N/A |
| Betadine Surgical Scrub (1 gallon) | Fisher Scientific | 19066452 |
| Ophthalmic Ointment (1 oz.) | Fisher Scientific | 19082795 |
Surgical Tools:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| FST 250 Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 |
| Iris Scissors (11 cm long) | World Precision Instruments | 500216 |
| Potts-Smith Forceps (Straight; 18cm; 1×2 Teeth) | Fine Science Tools | 11024-18 |
| McPherson-Vannas Scissors (5 mm blades) | World Precision Instruments | 14124-G |
| Dumont #5 Forceps – Dumoxel Standard Tip | Fine Science Tools | 11252-30 |
| Dumont #5/45 Forceps – Dumoxel Standard Tip | Fine Science Tools | 11251-35 |
| Ultra Fine Hemostats (Straight; Smooth Inside Surfaces) | Fine Science Tools | 13020-12 |
| Powdered Activated Carbon (500 g) | Fisher Scientific | C272-500 |
| Size 6-0 Sutures with C-1 Needle (Sterile, Silk, Black, Braided , Non-absorbable; 18” Length; Box of 36) | Roboz | SUT-1073-11 |
| Reflex Clip Applier (for 9 mm clips) | World Precision Instruments | 500345 |
| 9mm Stainless Steel Reflex Clips (100/box) | World Precision Instruments | 500346 |
Animal Care:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| 0.9% Sodium Chloride Injection (Preservative Free; 20 mL) | Hospira | 0409-4888-20 |
| Complete Homeothermic Blanket System with Flexible Probe (Medium, 115 VAC, 60 Hz) | Harvard Apparatus | 507222F |
Surgical Platform and Retractors:
(purchased at local hardware store)
| Name (description/) | Quantity |
| Stainless Steel Platform (Milled; ~12”x12”x1/8”) | 1 |
| Button Magnets (Example: Eclipse E825) | 3 |
| Stainless Steel Bolts (3” Long; Diameter Determined by Button Magnets) | 3 |
| Stainless Steel Nuts (Sized to Fit Bolts) | 9 |
| Rubber Bands (Light Tension) | 3 |
| Insect Pins (Both Ends Bent to Form Hooks) | 3 |
Semi-Thins:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| Paraformaldehyde (1 kg) | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (500 g; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | S375-500 |
| Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous (1 kg; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | AC38987-0010 |
| Glutaraldehyde (50%; 10 x 10 mL) | Ted Pella, Inc. | 18431 |
| Osmium Tetroxide (4% Aqueous, 10 x 10 mL) | Ted Pella, Inc. | 18465 |
| Propylene Oxide (450 mL) | Ted Pella, Inc. | 18601 |
| Embed 812 (Kit, for hard blocks/high image contrast) | Electron Microscopy Sciences | 14120 |
| Toluidine Blue (25 g) | Ted Pella, Inc. | 19451 |
Whole Mount Muscle Preparation and Immunohistochemistry:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| Paraformaldehyde (1 kg) | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (500 g; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | S375-500 |
| Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous (1 kg; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | AC38987-0010 |
| 10% BSA Diluent/Blocking Solution (200 mL) | Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. | 50-61-00 |
| Triton X-100 (100 mL) | Dot Scientific Incorporated | 9002-93-1 |
| Glycine, 98% (1 kg) | Fisher Scientific | AC12007-0010 |
| Tissue-Tek Cryo-OCT Compound (Case of 12; 4 oz bottles) | Fisher Scientific | 14-373-65 |
| Sylgard DOW 170 (2 lb. Kit) | Fisher Scientific | NC9492579 |
| Stainless Steel Insect Pins, Size 1 (100/pkg) | Fine Science Tools | 26001-40 |
| Tetramethylrhodamine-A-Bungarotoxin (0.5 mg) | Sigma-Aldrich | T0195-.5MG |
| Mouse Monoclonal Antibody Against SMI-312 (0.1 mL) | Covance | SMI-312R |
| Mouse Monoclonal Antibody Against SV2 (0.1 mL) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | SV2 |
| Rabbit Polyclonal Antibody Against GAP-43 | Novus Biologicals | NB300-143 |
| Flourescein Conjugated Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ Subclass 1 Specific | Jackson ImmunoResearch | 115-095-205 |
| DyLight 649 Conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-495-152 |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, dilactate; 10 mg) | Invitrogen | D3571 |
| Vectashield Mounting Medium (10 mL) | Vector Laboratories | H-1000 |
| Superfrost Plus Microscope Slides (White; Size: 75 x 25 mm; Pack of 144) | Fisher Scientific | 12-550-15 |
| Fisherfinest Premium Cover Glasses (Size: 40 x 22 mm; Pack of 1 oz.) | Fisher Scientific | 12-548-5C |
Referências
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- Beer, G. M., Steurer, J., Meyer, V. E. Standardizing nerve crushes with a non-serrated clamp. J. Reconstr. Microsurg. 17, 531-534 (2001).
Tags
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Citar este artigo
Bauder, A. R., Ferguson, T. A. Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis. J. Vis. Exp. (60), e3606, doi:10.3791/3606 (2012).