Vävnad mikromatriser möjliggör en effektiv metod för att få samtidig information från en mängd vävnader. Representativa delar av vävnader sätts samman till en enda paraffinblock. Sektioner från blocket används för immunohistokemi och analys av mönster proteinuttryck. Digital skanning genererar motsvarande bilder för distribution av data.
Vävnaden microarray (TMA)-teknik ger möjlighet för high-throughput analyser av flera vävnader och celler. Tekniken används inom Human Protein Atlas-projektet för global analys av mönster proteinuttryck i normala humana vävnader, cancer och cellinjer. Här presenterar vi montering av 1 mm kärnor, hämtas från mikroskopiskt utvalda representativa vävnader, till en enda mottagare TMA block. Antalet och storleken av kärnorna i en TMA-block kan varieras från ca 40 2 mm kärnor till hundratals 0,6 mm kärnor. Fördelen med att använda TMA tekniken är att stora mängder data snabbt kan erhållas med en enda immunfärgning protokoll för att undvika experimentell variation. Viktigt endast begränsad mängd knappa vävnad behövs, vilket gör det möjligt för analys av stora patientgrupper 1 2. Ca 250 på varandra följande sektioner (4 pm tjockt) kan skäras från ett TMA-block och användes för immunhistokemisk staining att fastställa specifika mönster proteiner uttryck för 250 olika antikroppar. I Human Protein Atlas-projektet är antikroppar genereras mot alla humana proteiner och används för att förvärva motsvarande protein profiler i både normala humana vävnader från 144 individer och vävnader cancer från 216 olika patienter, vilket motsvarar de 20 vanligaste formerna av cancer hos människor. Immunhistokemiskt färgade TMA avsnitt på objektglas scannas för att skapa bilder med hög upplösning som patologer kan tolka och kommentera resultatet av immunohistokemi. Bilder tillsammans med motsvarande patologi-baserade kommenteringsverktyg uppgifter görs offentligt tillgängliga för forskarsamhället genom Human Protein Atlas portal ( www.proteinatlas.org ) (Figur 1) 3 4. The Human Protein Atlas ger en karta som visar fördelningen och relativ förekomst av proteiner i människokroppen. Den nuvarande versionen innehåller mer än 11 miljoner bilder med data proteinuttryck för 12.238 unika proteiner, vilket motsvarar mer än 61% av alla proteiner som kodas av det humana genomet.
Immunohistokemi är den i särklass vanligaste ansökan om TMA. Kombinationen av IHC, och TMA kan användas i flera olika sammanhang, t.ex. high-throughput screening av mönster proteinuttryck i vävnader 7 8 och celler 9 10, biomarkörer studier baserade på vävnadsprover från stora patientgrupper 11 12 och mer grundläggande tumör biologi studier, inklusive olika fenotyper / genotyper, scener differentiering, utveckling och metastaser 13. En fördel med användning av TMA är att material från en stor skara kan analyseras på en gång, båda spara värdefull biologisk materialet och säkerställer mer reproducerbara experiment. Dessutom sparar användningen av TMA teknik reagens kostnader och laboratoriet handläggningstiden. Som en TMA bara innehåller en begränsad mängd vävnad, är vävnad heterogenitet ett problem. Beroende på vilken typ av vävnad och frågor som skall behandlas, kan flera prover behövs från samma specimen. För tumörvävnader är användningen av två till fyra kärnor från varje prov eftersom detta har visat sig resultera i en hög grad av noggrannhet i representationen av hela vävnadssnitt 13 14. Beroende på vävnaden komposition diametern hos stansarna (från 0,6 mm till 2 mm) kan justeras. Vävnader är komplexa och består av både flera olika celltyper, strukturer och extracellulär matrix. Sammansättningen av varje annan vävnadstyp innehållande varierande mängd fett, kommer blodkärl, bindväv, brosk etc, påverkar det tryck som behövs för stansning och uppsamling separata kärnor. Det är därför viktigt att träna alla steg i proceduren på material som inte är av något värde, innan en TMA med definierade vävnader för de avsedda försöken.
När sektionering en mängd olika vävnader inom en TMA kvarter sammansättningen av blocket skulle kunna påverka förmågan att förvärva hög kvalitet sektioner. Certain vävnader, t.ex. hud, benmärg, fett, hjärna och bröst, gör sektionering av TMA blocket svårt på grund av effekten av skillnader i textur som påverkar hur avsnitten sträcka ut i vattenbadet och hur olika hårdhet skärs av bladet etc. Det rekommenderas därför att gruppera vävnader med liknande egenskaper, t.ex. lipid rika vävnad i en TMA, i förekommande fall. Majoriteten av cancer vävnader är i denna mening homogena, vilket underlättar sektionering av cancer TMA. En alternativ sektionering förfarande för stabilisering av mikromatrisen kärnorna kan användas vid hantering av en TMA med heterogena typer av vävnader. Användningen av en adhesiv tejp kan vara till hjälp för att undvika förlust av kärnor och fall-out i den sektionerade TMA. Användningen av tejp bör användas med försiktighet, eftersom bandet kan påverka tjockleken på sektionerade kärnor och senare även resultatet av IHC färgning 15. I Human Protein Atlas ställa upp en TMA mall för 9×8 (exklusive markörer) kärnor are användas. Det är viktigt att få maximalt antal sektioner och hålla alla vävnader representerade hela blocket. För att spara reagenser och scanning tid är 2 sektioner placeras på en glasskiva medger en maximalt mall av 9×8.
Den största databas för protein information inkluderar Universal Protein Resource 16 ungefär 20,300 omdömet mänskliga protein poster, varav endast cirka 66% har bevis på proteinnivå. Även för en majoritet av de gener för vilka det finns tecken på existens på proteinnivå finns knappt eller ingen information om proteiners funktion och distribution av uttryck. En viktig utmaning för framtiden är att analysera fördelningen mönstret och relativ förekomst av dessa okända proteiner i olika typer av mänsklig vävnad. Informationen från databaser som Uniprot, Ensembl, publicerade data från PubMed kan användas som en vägledning för att fastställa om immunhistokemiska färgningsmönster med antikroppar motavdelningar okända proteiner representerar faktiska proteinprofiler av den avsedda mål-proteinet. Dessutom är flera andra strategier för validering för att säkerställa antikropp funktionalitet, till exempel antikroppar funktionalitet i protein arrayer, Western blot, immunofluorescens, immuno-nederbörd och pull-down experiment. Kanske det viktigaste verktyget för validering av antikroppar funktioner är att använda parade antikroppar, dvs två olika antikroppar riktade mot olika, icke-överlappande epitoper på samma målprotein, att jämföra analysen specifik resultatet 17.
Baserat på sammanställs information, antikroppar testas och titreras i enlighet med IHC normer och erfarenheter från testning och validering av över 35.000 antikroppar i Human Protein Atlas-projektet. För över 20% av alla gener med proteinprofiler har data från parade antikroppar i 2 eller flera antikroppar mot icke-överlappande epitoper på samma protein) använts för att bestämma en bästa uppskattmate av motsvarande protein expressionsmönster. Kopplade antikroppar ger ett ultimat strategi för att validera specifika immunohistokemi-baserade mönster protein uttryck. Denna strategi är värdefull eftersom den mångfald av olika vävnader som ingår i den grundläggande screening ökar risken för korsreaktivitet. Det bör också noteras att vissa vävnader i allmänhet mer benägna att visa bakgrundsfärgning t.ex. makrofager, glatt muskulatur, distala tubuli i njure och hepatocyter i levern. Ytterligare frågor att ta i beaktande skillnaderna i tekniker vävnadsbehandling över tiden för de vävnader som tas från arkivmaterial, vilket kan resultera i falskt negativa eller olämplig positiva IHC färgningsmönster. Detta fenomen kan också påträffas i stor del analys. Både negativa och positiva kontroller är viktigt och bör användas när det är möjligt. För djupare studier inkluderande funktionella analyser, cellinjer med tvingas uttryck och specifika knock-down för motsvarande transcripts (siRNA-teknik) kan användas för att skapa kontroller. För bästa resultat i IHC, är det viktigt att testa och använda system antigenåtervinning, eftersom formalin fixeringen inducerar olika kemiska modifieringar, t.ex. tvärbindning, hydrolys av Schiffs baser mask antigenet 18.
Sammanfattningsvis är antikroppsbaserade proteomik använder TMA teknik och IHC en kraftfull strategi för att generera data som protein uttryck i stor skala. The Human Protein Atlas-projektet har inrättats för att skapa en karta över humant protein uttryck i normala humana vävnader och cancer. Syftet med detta projekt är att presentera ett första utkast till en övergripande Human Protein Atlas 2015. Förutom att ge protein profiler i normala organ och vävnader, ger detta arbete också en utgångspunkt för biomedicinska forskningsprojekt, inklusive kliniska försök biomarkörer. Det slutliga målet är att lägga en nästa information ovanpå det mänskliga genomet sekvens som wikommer att vara avgörande för en djupare förståelse av biologin bakom olika sjukdomstillstånd och ge en grund för att utveckla nya diagnostiska och terapeutiska verktyg.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats med bidrag från Knut och Alice Wallenbergs stiftelse. Hela stavar av Human Protein Atlas center i Uppsala, Stockholm och Indien känd för sina ansträngningar att generera Human Protein Atlas. Författarna vill speciellt tacka Frank Hammar och Sofie Gustafsson för att få hjälp med bilder och Elene Karlberg för att få hjälp med TMA produktionen när filmar.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Wash buffer | Thermo Fisher Scientific | TA-999-TT |
Citrate buffer pH6 | Thermo Fisher Scientific | TA-250-Pm1X |
Antibody diluent | Thermo Fisher Scientific | TA-125-UD |
UltraVision LP HRP polymer | Thermo Fisher Scientific | TL-125-HL |
DAB plus substrate system | Thermo Fisher Scientific | TA-125-HDX |
Ultra V Block | Thermo Fisher Scientific | TA-125-UB |
Primary Antibody Enhancer | Thermo Fisher Scientific | TL-125-PB |
Mayers hematoxylin | Histolab | 01820 |
PERTEX | Histolab | 00871.0500 |
Name of the equipment | Company | Catalogue number |
Manual tissue micro arrayer | Estigen, Beecher Instrument | MTA-1 |
Waterfall microtome | Thermo Fisher Scientific | Microm HM 355S |
Automated image scanner | Aperio Technologies | XT |
Automated slide staining system | Thermo Fisher Scientific | Autostainer 480S-2D |
Automated slide staining system for deparafinization and dehydration | Leica Biosystems | Autostainer XL |
Automated glass coverslipper | Leica Biosystems | CV5030 |
Decloaking chamber | Biocare Medical | DC2008INTEL |