Udarbejdelse af 3D Fibrin stilladser til Stem celledyrkningsapplikationer

Summary

Dette arbejde nærmere udarbejdelse af 3D fibrin stilladser til dyrkning og differentiering plutipotent stamceller. Sådanne stilladser kan anvendes til at screene virkningerne af forskellige biologiske forbindelser på stamceller adfærd såvel som modificeret til at indeholde medikamentudleveringssystemer.

Abstract

Stamceller findes i naturligt forekommende 3D ​​mikromiljøer in vivo, hvilket ofte omtales som stamcellen niche ^1. Dyrkning stamceller indersiden af 3D biomateriale stilladser tilvejebringer en måde til præcist efterligner disse mikromiljøer, hvilket giver en fordel i forhold til traditionelle 2D dyrkningsmetoder med polystyren samt en fremgangsmåde til splejsning af udskiftning af væv ^2. Mens 2D vævskultur polystyren er blevet anvendt til de fleste celledyrkningsforsøg kan 3D biomateriale scaffolds nærmere replikere mikromiljøer fundet in vivo ved at muliggøre mere nøjagtig fastlæggelse af celle polaritet i miljøet, og som besidder biokemiske og mekaniske egenskaber svarende til blødt væv. ^3. En række naturligt afledte og syntetiske biomateriale scaffolds er blevet undersøgt som 3D-miljøer til understøtning stamcelle vækst. Medens syntetiske stilladser kan syntetiseres til at have en større rAnge af mekaniske og kemiske egenskaber og har ofte en større reproducerbarhed, er naturlige biomaterialer ofte sammensat af proteiner og polysaccharider, der findes i den ekstracellulære matrix og som et resultat indeholder bindingssteder for celleadhæsion og let støtte cellekultur. Fibrin stilladser, fremstillet ved polymerisering af proteinet fibrinogen fra plasma, har været bredt undersøgt til forskellige vævsdyrkningsapplikationer både de vitro og in vivo ^4. Sådanne stilladser kan modificeres ved anvendelse af en række fremgangsmåder til at optage systemer med kontrolleret frigivelse til afgivelse af terapeutiske faktorer ^5. Tidligere arbejde har vist, at sådanne stilladser kan anvendes til vellykket dyrkning embryonale stamceller og denne scaffold-baserede kultursystem kan anvendes til at screene virkningerne af forskellige vækstfaktorer på differentiering af stamcellerne podet ind ^6,7.

Denne protokol detaljer processen med polymerizing fibrin stilladser fra fibrinogen løsninger ved hjælp af den enzymatiske aktivitet af thrombin. Processen tager 2 dage at gennemføre, herunder en dialyse natten skridt for fibrinogenopløsning at fjerne citrater, der hæmmer polymerisering. Disse detaljerede fremgangsmåder er afhængige af fibrinogenkoncentrationer bestemt til at være optimal for embryonisk og induceret pluripotente stamcelle kultur. Andre grupper har yderligere undersøgt fibrin stilladser til en lang række celletyper og anvendelser – viser alsidigheden af denne fremgangsmåde ^8-12.

Protocol

Bemærkninger, før du starter protokol: Fibrinogen er en blod afledt protein og dermed relevant uddannelse i sikkerhed skal være afsluttet inden håndtering. Denne protokol kræver 2 dage at fuldføre så tiden de ønskede stamceller kulturer hensigtsmæssigt at sikre, at de er klar til såning. I form af beregningen hvor meget fibrinogen at afveje tre 35 mm petriskåle i tris-bufret saltvand (TBS, pH 7,4) indeholdende 110 til 130 mg fibrinogen opløses i 3 ml TBS vil være tilstrækkelig til at fremb…

Discussion

Denne protokol beskrevet ovenfor tilvejebringer en fremgangsmåde til generering af 3D fibrin stilladser til pluripotente stamcelle kultur specifikt muse embryonale og inducerede pluripotente stamceller. Denne 3D biomateriale baseret kultur system mere nøjagtigt efterligner stamcelle niche findes de vivo, og som følge heraf kan det anvendes til at screene biologiske signaler for at bestemme deres virkninger på stamcelle-differentiation ^6. Vore observationer har vist, at disse scaffolds ve…

Materials

Equipment needed:

Analytical balance
pH meter
Tissue culture incubator (37°C, 5% CO₂)
Stir plate
Spectrophotometer
Sterile tissue culture hood

Tris buffered saline (pH 7.4) (Need 4 L plus enough for dissolving fibrinogen)
50 mM calcium chloride solution
Sterile conical tubes (15 or 50 mL)
35 mm Petri dishes
Dialysis tubing (7,000 MW cutoff)
Dialysis clips
5.0 μm syringe filters
Individually wrapped sterile 0.22 μm syringe filters
Syringe
24 well tissue culture plates

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Fibrinogen (human)	Calbiochem	341578
Thrombin (human)	Sigma	T7009