Voorbereiding van de 3D-fibrine steigers voor Stem Cell Cultuur Toepassingen
Summary
Dit werk beschrijft de voorbereiding van de 3D-fibrine steigers voor het kweken en te differentiëren plutipotent stamcellen. Dergelijke draagstructuren kunnen worden gebruikt om de effecten van verschillende biologische verbindingen op stamcellen gedrag vertonen en aangepast medicijnafgiftesystemen bevatten.
Abstract
Stamcellen in de natuur voorkomende micro-omgevingen 3D in vivo, die vaak worden aangeduid als de stamcel nis 1. Kweken stamcellen in 3D biomateriaal scaffolds een manier om nauwkeurig na te bootsen deze micro-omgevingen, die een ten opzichte van traditionele 2D kweekmethoden met polystyreen als een werkwijze voor technische vervangende weefsels 2. Terwijl 2D weefselkweek polystyreen is gebruikt voor de meerderheid van de celkweek experimenten, kan 3D-biomateriaal steigers beter een kopie van de micro-omgevingen in vivo door zodat een nauwkeurigere oprichting van de cel polariteit in het milieu en het bezit van biochemische en mechanische eigenschappen die vergelijkbaar zijn weke delen. 3 Een variëteit aan natuurlijk verkregen en synthetische biomateriaal steigers werden bestudeerd als een 3D-omgevingen voor de ondersteuning van stamcellen groei. Terwijl synthetische steigers kunnen worden gesynthetiseerd een grotere r hebbenange van mechanische en chemische eigenschappen en vaak grotere reproduceerbaarheid worden natuurlijke biomaterialen vaak uit eiwitten en Polysacchariden in de extracellulaire matrix en daardoor bevatten bindingsplaatsen voor celhechting en gemakkelijk ondersteunen celkweek. Fibrine steigers, door polymeriseren van het eiwit fibrinogeen verkregen plasma, zijn uitgebreid onderzocht voor diverse technische toepassingen tissue in vitro pt in vivo 4. Dergelijke draagstructuren kunnen worden gemodificeerd met verschillende methoden voor gecontroleerde vrijgave omvatten systemen voor het afgeven van therapeutische factoren 5. Vroeger werk heeft aangetoond dat dergelijke steigers kan worden succes cultuur embryonale stamcellen en de scaffold gebaseerde cultuur systeem kan worden gebruikt om de effecten van verschillende groeifactoren op de differentiatie van de stamcellen geënt in 6,7 screenen.
Dit protocol stelt de procedure van polymerizing fibrine steigers uit fibrinogeen oplossingen met de enzymatische activiteit van trombine. Het duurt twee dagen in beslag, zoals een nacht dialysestap de fibrinogeen oplossing citraten dat polymerisatie remt verwijderen. Deze gedetailleerde methoden rekenen op fibrinogeen concentraties vastgesteld dat het optimaal is voor de embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen cultuur. Andere groepen verder onderzocht fibrine dragers voor een groot bereik aan celtypen en toepassingen – aantonen van de veelzijdigheid van deze benadering 8-12.
Protocol
Discussion
Dit protocol hierboven beschreven biedt een methode voor het genereren van 3D-fibrine steigers voor pluripotente stamcellen cultuur, specifiek voor muis embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen. Deze 3D biomateriaal gebaseerd teeltsysteem nauwkeuriger bootst de stamcellen nis in vivo en daardoor kan worden gebruikt om biologische signalen screenen om hun effecten op stamceldifferentiatie 6 bepalen. Onze observaties hebben aangetoond dat deze steigers toen gezaaid met zijn afgeleid van stam…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag NSERC Discovery Grant 402462 "weefselmanipulatieproduct steigers voor het regelen van geïnduceerde pluripotente stamcellen zijn gedrag" te erkennen.
Materials
Equipment needed:
Analytical balance
pH meter
Tissue culture incubator (37°C, 5% CO2)
Stir plate
Spectrophotometer
Sterile tissue culture hood
Tris buffered saline (pH 7.4) (Need 4 L plus enough for dissolving fibrinogen)
50 mM calcium chloride solution
Sterile conical tubes (15 or 50 mL)
35 mm Petri dishes
Dialysis tubing (7,000 MW cutoff)
Dialysis clips
5.0 μm syringe filters
Individually wrapped sterile 0.22 μm syringe filters
Syringe
24 well tissue culture plates
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fibrinogen (human) | Calbiochem | 341578 | |
| Thrombin (human) | Sigma | T7009 |
Referências
- Keung, A. J., Healy, K. E., Kumar, S., Schaffer, D. V. Biophysics and dynamics of natural and engineered stem cell microenvironments. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2, 49-64 (2010).
- Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery. StemBook. , (2008).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue Eng. Part B Rev. 14, 61-86 (2008).
- Ahmed, T. A., Dare, E. V., Hincke, M. Fibrin: a versatile scaffold for tissue engineering applications. Tissue Eng. Part B Rev. 14, 199-215 (2008).
- Breen, A., O’Brien, T., Pandit, A. Fibrin as a delivery system for therapeutic drugs and biomolecules. Tissue Eng. Part B Rev. 15, 201-214 (2009).
- Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds. Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).
- Willerth, S. M., Arendas, K. J., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. Optimization of fibrin scaffolds for differentiation of murine embryonic stem cells into neural lineage cells. Biomaterials. 27, 5990-6003 (2006).
- Gorodetsky, R. Fibrin Microbeads Loaded with Mesenchymal Cells Support Their Long-Term Survival While Sealed at Room Temperature. Tissue Eng. Part C Methods. , (2011).
- Barsotti, M. C. Fibrin acts as biomimetic niche inducing both differentiation and stem cell marker expression of early human endothelial progenitor cells. Cell Prolif. 44, 33-48 (2011).
- Park, J. S., Yang, H. N., Woo, D. G., Jeon, S. Y., Park, K. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells in fibrin constructs evaluated in vitro and in nude mouse and rabbit defects models. Biomaterials. 32, 1495-1507 (2011).
- Mooney, R., Tawil, B., Mahoney, M. Specific fibrinogen and thrombin concentrations promote neuronal rather than glial growth when primary neural cells are seeded within plasma-derived fibrin gels. Tissue Eng. Part A. 16, 1607-1619 (2010).
- Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).
- Dellenback, R. J., Chien, S. The extinction coefficient of fibrinogen from man, dog, elephant, sheep, and goat at 280 mmu. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 134, 353-355 (1970).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Li, X. J. Directed differentiation of ventral spinal progenitors and motor neurons from human embryonic stem cells by small molecules. Stem Cells. 26, 886-893 (2008).
- Lorentz, K. M., Kontos, S., Frey, P., Hubbell, J. A. Engineered aprotinin for improved stability of fibrin biomaterials. Biomaterials. 32, 430-438 (2011).
- Willerth, S. M., Rader, A., Sakiyama-Elbert, S. E. The effect of controlled growth factor delivery on embryonic stem cell differentiation inside fibrin scaffolds. Stem Cell Res. 1, 205-218 (2008).
- Chen, S. J. Functional improvement of focal cerebral ischemia injury by subdural transplantation of induced pluripotent stem cells with fibrin glue. Stem Cells Dev. 19, 1757-1767 (2010).
