Preparazione del 3D fibrina ponteggi per le applicazioni delle cellule staminali Cultura
Summary
Questi i dettagli del lavoro per la preparazione di fibrina scaffold 3D per la coltura e differenziazione delle cellule staminali plutipotent. Tali ponteggi può essere usata per selezionare gli effetti di vari composti biologici sul comportamento cellule staminali nonché modificata per contenere sistemi di drug delivery.
Abstract
Cellule staminali si trovano in natura microambienti 3D in vivo, che sono spesso denominati nicchia cellule staminali 1. Coltura di cellule staminali all'interno di 3D scaffold biomateriale fornisce un modo per riprodurre accuratamente questi microambienti, fornendo un vantaggio rispetto ai tradizionali metodi di coltura 2D utilizzando polistirene nonché un metodo per tessuti di ricambio ingegneria 2. Mentre 2D polistirene coltura tissutale è stato utilizzato per la maggior parte degli esperimenti di coltura cellulare, 3D ponteggi biomateriale può più strettamente replicare i microambienti trovate in vivo consentendo costituzione più accurata di polarità cella nell'ambiente e possiede proprietà biochimiche e meccaniche simili a tessuti molli. 3 Una varietà di derivazione naturale e sintetico ponteggi biomateriale sono stati studiati come ambienti in 3D per sostenere la crescita delle cellule staminali. Mentre ponteggi sintetici possono essere sintetizzati per avere una maggiore range di proprietà meccaniche e chimiche e spesso hanno una maggiore riproducibilità, biomateriali naturali sono spesso composti di proteine e polisaccaridi presenti nella matrice extracellulare e di conseguenza contengono siti di legame per l'adesione cellulare e facilmente sostenere la coltura cellulare. Ponteggi fibrina, prodotto polimerizzando il fibrinogeno proteina ottenuta da plasma, sono stati ampiamente studiati per una varietà di applicazioni di ingegneria tissutale sia in vitro e in vivo 4. Tali ponteggi può essere modificata utilizzando una varietà di metodi per incorporare sistemi a rilascio controllato per fornire fattori terapeutici 5. Studi precedenti hanno dimostrato che tali ponteggi può essere utilizzato con successo per coltura di cellule staminali embrionali e questo scaffold sistema di coltura può essere usata per selezionare gli effetti di vari fattori di crescita sulla differenziazione delle cellule staminali seminate dentro 6,7.
Questo protocollo dettagli il processo di polymerizing fibrina ponteggi da soluzioni fibrinogeno utilizzando l'attività enzimatica della trombina. Il processo si fa in 2 giorni per completare, compresa una fase di dialisi per tutta la notte per la soluzione del fibrinogeno per rimuovere citrati che inibiscono la polimerizzazione. Questi metodi dettagliati contare su concentrazioni di fibrinogeno determinati a essere ottimale per la coltura embrionale e indotto cellule staminali pluripotenti. Altri gruppi hanno ulteriormente investigato ponteggi fibrina per una vasta gamma di tipi di cellule e applicazioni – dimostrare la versatilità di questo approccio 8-12.
Protocol
Discussion
Questo protocollo dettagliato sopra fornisce un metodo per generare 3D ponteggi di fibrina per la coltura di cellule staminali pluripotenti, in particolare per embrionali di topo e cellule staminali pluripotenti indotte. Questo sistema biomateriale cultura 3D basato più accuratamente imita la nicchia delle cellule staminali trovato in vivo e, di conseguenza, può essere usata per selezionare segnali biologici per determinare i loro effetti sulla differenziazione delle cellule staminali 6. Le nostre …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare NSERC Discovery Grant 402462 "scaffolds di ingegneria tessutale indotta per il controllo delle cellule staminali pluripotenti comportamento".
Materials
Equipment needed:
Analytical balance
pH meter
Tissue culture incubator (37°C, 5% CO2)
Stir plate
Spectrophotometer
Sterile tissue culture hood
Tris buffered saline (pH 7.4) (Need 4 L plus enough for dissolving fibrinogen)
50 mM calcium chloride solution
Sterile conical tubes (15 or 50 mL)
35 mm Petri dishes
Dialysis tubing (7,000 MW cutoff)
Dialysis clips
5.0 μm syringe filters
Individually wrapped sterile 0.22 μm syringe filters
Syringe
24 well tissue culture plates
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fibrinogen (human) | Calbiochem | 341578 | |
| Thrombin (human) | Sigma | T7009 |
Referências
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