Utarbeidelse av 3D Fibrin stillaser for Stem Cell Kultur Applications
Summary
Dette arbeidet detaljer utarbeidelse av 3D fibrin stillasene for dyrkning og differensierende plutipotent stamceller. Slike stillasene kan brukes til å screene effekten av ulike biologiske forbindelser på stamcelleforskningen atferd samt modifisert for å inneholde stoffet leveringssystemer.
Abstract
Stamceller finnes i naturlig forekommende 3D microenvironments in vivo, som ofte omtales som stamcelleforskningen nisje en. Dyrkning stamceller innsiden av 3D biomateriale stillasene gir en måte å nøyaktig etterligne disse microenvironments, som gir en fordel fremfor tradisjonelle 2D kultur metoder ved hjelp av isopor, samt en metode for ingeniør erstatning vev 2. Mens 2D vevskultur polystrene har vært brukt for de fleste av cellekultur eksperimenter, kan 3D biomateriale stillasene nærmere gjenskape microenvironments funnet i vivo ved at mer nøyaktig etablering av celle polaritet i miljøet og er i besittelse biokjemiske og mekaniske egenskaper som ligner på mykt vev. 3 Et utvalg av naturlig utvunnet og syntetiske biomateriale stillasene har blitt etterforsket som 3D-miljøer som støtter stamcelleforskningen vekst. Mens syntetiske stillasene kan syntetiseres å ha en større range av mekaniske og kjemiske egenskaper og ofte har større reproduserbarhet, er naturlige biomaterialer ofte sammensatt av proteiner og polysakkarider som finnes i ekstracellulære matrix og som et resultat inneholde bindingssteder for celle adhesjon og lett støtte cellekultur. Fibrin stillasene, produsert av polymerizing proteinet fibrinogen fremstilt fra plasma, har vært mye undersøkt for en rekke av tissue engineering programmer både in vitro og de vivo 4. Slike stillasene kan endres ved hjelp av en rekke metoder for å innlemme kontrollert frisetting systemer for å levere terapeutiske faktorer 5. Tidligere arbeid har vist at slike stillasene kan brukes til å lykkes kultur embryonale stamceller og dette stillaset-baserte kultur systemet kan brukes til å screene effekten av ulike vekstfaktorer om differensiering av stamceller seeded inne 6,7.
Denne protokollen beskriver prosessen med polymerizing fibrin stillasene fra fibrinogen løsninger ved hjelp av enzymatisk aktivitet av trombin. Prosessen tar 2 dager å fullføre, inkludert en overnatting dialyse steg for fibrinogen løsningen for å fjerne Citrates som hemmer polymerisering. Disse detaljerte metoder avhengige av fibrinogen konsentrasjoner bestemt på å være optimal for embryo-og indusert pluripotent stamcelle kultur. Andre grupper har videre undersøkt fibrin stillasene for et bredt spekter av celletyper og applikasjoner – demonstrere allsidigheten til denne tilnærmingen 8-12.
Protocol
Discussion
Denne protokollen beskrevet ovenfor gir en metode for generering av 3D fibrin stillasene for pluripotent stamcelleforskningen kultur, spesielt for mus embryo-og induserte pluripotent stamceller. Denne 3D biomateriale baserte kultur systemet mer nøyaktig etterligner stamcelleforskningen nisje funnet in vivo og som et resultat, kan det brukes til å screene biologiske signaler for å bestemme deres virkninger på stamcelleforskningen differensiering 6. Våre observasjoner har vist at disse stillasene …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke NSERC Discovery Grant 402462 "tissue konstruerte stillaser for å kontrollere indusert pluripotent stamcelleforskningen atferd".
Materials
Equipment needed:
Analytical balance
pH meter
Tissue culture incubator (37°C, 5% CO2)
Stir plate
Spectrophotometer
Sterile tissue culture hood
Tris buffered saline (pH 7.4) (Need 4 L plus enough for dissolving fibrinogen)
50 mM calcium chloride solution
Sterile conical tubes (15 or 50 mL)
35 mm Petri dishes
Dialysis tubing (7,000 MW cutoff)
Dialysis clips
5.0 μm syringe filters
Individually wrapped sterile 0.22 μm syringe filters
Syringe
24 well tissue culture plates
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fibrinogen (human) | Calbiochem | 341578 | |
| Thrombin (human) | Sigma | T7009 |
Referências
- Keung, A. J., Healy, K. E., Kumar, S., Schaffer, D. V. Biophysics and dynamics of natural and engineered stem cell microenvironments. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2, 49-64 (2010).
- Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery. StemBook. , (2008).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue Eng. Part B Rev. 14, 61-86 (2008).
- Ahmed, T. A., Dare, E. V., Hincke, M. Fibrin: a versatile scaffold for tissue engineering applications. Tissue Eng. Part B Rev. 14, 199-215 (2008).
- Breen, A., O’Brien, T., Pandit, A. Fibrin as a delivery system for therapeutic drugs and biomolecules. Tissue Eng. Part B Rev. 15, 201-214 (2009).
- Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds. Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).
- Willerth, S. M., Arendas, K. J., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. Optimization of fibrin scaffolds for differentiation of murine embryonic stem cells into neural lineage cells. Biomaterials. 27, 5990-6003 (2006).
- Gorodetsky, R. Fibrin Microbeads Loaded with Mesenchymal Cells Support Their Long-Term Survival While Sealed at Room Temperature. Tissue Eng. Part C Methods. , (2011).
- Barsotti, M. C. Fibrin acts as biomimetic niche inducing both differentiation and stem cell marker expression of early human endothelial progenitor cells. Cell Prolif. 44, 33-48 (2011).
- Park, J. S., Yang, H. N., Woo, D. G., Jeon, S. Y., Park, K. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells in fibrin constructs evaluated in vitro and in nude mouse and rabbit defects models. Biomaterials. 32, 1495-1507 (2011).
- Mooney, R., Tawil, B., Mahoney, M. Specific fibrinogen and thrombin concentrations promote neuronal rather than glial growth when primary neural cells are seeded within plasma-derived fibrin gels. Tissue Eng. Part A. 16, 1607-1619 (2010).
- Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).
- Dellenback, R. J., Chien, S. The extinction coefficient of fibrinogen from man, dog, elephant, sheep, and goat at 280 mmu. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 134, 353-355 (1970).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Li, X. J. Directed differentiation of ventral spinal progenitors and motor neurons from human embryonic stem cells by small molecules. Stem Cells. 26, 886-893 (2008).
- Lorentz, K. M., Kontos, S., Frey, P., Hubbell, J. A. Engineered aprotinin for improved stability of fibrin biomaterials. Biomaterials. 32, 430-438 (2011).
- Willerth, S. M., Rader, A., Sakiyama-Elbert, S. E. The effect of controlled growth factor delivery on embryonic stem cell differentiation inside fibrin scaffolds. Stem Cell Res. 1, 205-218 (2008).
- Chen, S. J. Functional improvement of focal cerebral ischemia injury by subdural transplantation of induced pluripotent stem cells with fibrin glue. Stem Cells Dev. 19, 1757-1767 (2010).
