3D Fibrin hazırlanması Kök Hücre Kültürü Uygulamaları için iskeleleri
Summary
Bu çalışma detayları 3D fibrin hazırlanması kültür ve plutipotent kök hücrelerin ayrıştırılması için iskeleleri. Bu tür iskelesi sıra ilaç verme sistemleri içeren değiştirilmiş olarak kök hücre davranışı üzerindeki çeşitli biyolojik etkiler bileşiklerin taranması için kullanılabilir.
Abstract
Kök hücreler doğal genellikle kök hücre hücresi 1 olarak adlandırılan in vivo, in 3D mikro meydana bulunur. 3D biyomalzeme iskelelerinin içinde Kültürleme kök hücreler polistiren yanı sıra, mühendislik yedek dokular 2 için bir yöntem kullanılarak geleneksel 2B kültür yöntemleri üzerinde bir avantaj sağlayarak, doğru bir şekilde bu mikro taklit etmek için bir yol sağlar. 2B doku kültürü polistren hücre kültür deneylerinde çoğunluğu için kullanılmış olsa da, 3D biyomalzeme iskelelerinin daha yakından ortamında hücre polarite daha doğru kurulmasını sağlayan ve yumuşak doku benzer biyokimyasal ve mekanik özelliklere sahip olan in vivo olarak bulundu mikroçevrelerde çoğaltabilirsiniz. 3 çeşitli doğal kaynaklı ve sentetik biyomalzeme iskelelerde kök hücre büyümesini desteklemek için 3D ortamlar olarak incelenmiştir. Sentetik iskelesi daha büyük bir r sahip sentezlenebilir ikenmekanik ve kimyasal özellikleri ange ve genellikle daha büyük bir tekrarlanabilirlik sahip, doğal biyomalzemeler genellikle extracelluar matris içinde ve hücre yapışması için bağlama bölgeleri içermesi ve kolaylıkla hücre kültürü destekleyen bir sonucu olarak bulundu proteinleri ve polisakkaritleri oluşmaktadır. Plazma elde edilen protein fibrinojen polimerize tarafından üretilen fibrin iskelesi, yaygın olarak in vitro ve in vivo hem de de 4 doku mühendisliği çeşitli uygulamalar için incelenmiştir. Böyle iskeleleri iyileştirici faktörler, 5 sunmak için kontrollü salım sistemlerini birleştirmek için çeşitli yöntemler kullanılarak değiştirilebilir. Önceki İş bu iskeleleri başarıyla kültür embriyonik kök hücreler için kullanılabilir ve bu iskele tabanlı kültür sistemi 6,7 içindeki ekilmiş kök hücrelerin farklılaşması üzerine çeşitli büyüme faktörlerinin etkilerini taramak için kullanılabilir göstermiştir.
Bu protokol, ayrıntıları polymerizin işlemig fibrin trombinin enzim etkinliği kullanarak fibrine çözeltilerinden iskeleleri. Polimerizasyon süreci inhibe sitratlar kaldırmak için fibrinojen çözümü için bir gece diyaliz adım da dahil olmak üzere, tamamlamak için 2 gün sürer. Bu detaylı yöntemleri embriyonik ve uyarılmış pluripotent kök hücre kültürleri için optimal olarak belirlenmiştir fibrinojen güveniyor. Diğer gruplar daha fazla hücre tipleri ve geniş bir uygulama yelpazesi için fibrin iskeleleri araştırdık – Bu yaklaşımın 8-12 çok yönlülüğünü gösteren.
Protocol
Discussion
Yukarıda detaylı Bu protokol, fare embriyonik ve uyarılmış pluripotent kök hücreleri için özel olarak, pluripotent kök hücre kültürü için 3D fibrin iskelesi üretmek için bir yöntem sağlar. Bu 3D biyomalzemenin bazlı kültürü sistemi daha doğru bir in vivo olarak bulundu kök hücre hücresi taklit eder ve bunun sonucu olarak, bu kök hücre farklılaşması 6 üzerindeki etkilerinin belirlenmesi için biyolojik kuyrukları taranması için kullanılabilir. Gözlemlerimiz bu isk…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, "uyarılmış pluripotent kök hücre davranışlarını kontrol için doku mühendisliği iskeleleri" NSERC Discovery Hibe 402.462 tanımak istiyoruz.
Materials
Equipment needed:
Analytical balance
pH meter
Tissue culture incubator (37°C, 5% CO2)
Stir plate
Spectrophotometer
Sterile tissue culture hood
Tris buffered saline (pH 7.4) (Need 4 L plus enough for dissolving fibrinogen)
50 mM calcium chloride solution
Sterile conical tubes (15 or 50 mL)
35 mm Petri dishes
Dialysis tubing (7,000 MW cutoff)
Dialysis clips
5.0 μm syringe filters
Individually wrapped sterile 0.22 μm syringe filters
Syringe
24 well tissue culture plates
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fibrinogen (human) | Calbiochem | 341578 | |
| Thrombin (human) | Sigma | T7009 |
Referências
- Keung, A. J., Healy, K. E., Kumar, S., Schaffer, D. V. Biophysics and dynamics of natural and engineered stem cell microenvironments. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2, 49-64 (2010).
- Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery. StemBook. , (2008).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue Eng. Part B Rev. 14, 61-86 (2008).
- Ahmed, T. A., Dare, E. V., Hincke, M. Fibrin: a versatile scaffold for tissue engineering applications. Tissue Eng. Part B Rev. 14, 199-215 (2008).
- Breen, A., O’Brien, T., Pandit, A. Fibrin as a delivery system for therapeutic drugs and biomolecules. Tissue Eng. Part B Rev. 15, 201-214 (2009).
- Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds. Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).
- Willerth, S. M., Arendas, K. J., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. Optimization of fibrin scaffolds for differentiation of murine embryonic stem cells into neural lineage cells. Biomaterials. 27, 5990-6003 (2006).
- Gorodetsky, R. Fibrin Microbeads Loaded with Mesenchymal Cells Support Their Long-Term Survival While Sealed at Room Temperature. Tissue Eng. Part C Methods. , (2011).
- Barsotti, M. C. Fibrin acts as biomimetic niche inducing both differentiation and stem cell marker expression of early human endothelial progenitor cells. Cell Prolif. 44, 33-48 (2011).
- Park, J. S., Yang, H. N., Woo, D. G., Jeon, S. Y., Park, K. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells in fibrin constructs evaluated in vitro and in nude mouse and rabbit defects models. Biomaterials. 32, 1495-1507 (2011).
- Mooney, R., Tawil, B., Mahoney, M. Specific fibrinogen and thrombin concentrations promote neuronal rather than glial growth when primary neural cells are seeded within plasma-derived fibrin gels. Tissue Eng. Part A. 16, 1607-1619 (2010).
- Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).
- Dellenback, R. J., Chien, S. The extinction coefficient of fibrinogen from man, dog, elephant, sheep, and goat at 280 mmu. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 134, 353-355 (1970).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Li, X. J. Directed differentiation of ventral spinal progenitors and motor neurons from human embryonic stem cells by small molecules. Stem Cells. 26, 886-893 (2008).
- Lorentz, K. M., Kontos, S., Frey, P., Hubbell, J. A. Engineered aprotinin for improved stability of fibrin biomaterials. Biomaterials. 32, 430-438 (2011).
- Willerth, S. M., Rader, A., Sakiyama-Elbert, S. E. The effect of controlled growth factor delivery on embryonic stem cell differentiation inside fibrin scaffolds. Stem Cell Res. 1, 205-218 (2008).
- Chen, S. J. Functional improvement of focal cerebral ischemia injury by subdural transplantation of induced pluripotent stem cells with fibrin glue. Stem Cells Dev. 19, 1757-1767 (2010).
