एक Adenovirus व्यक्त प्रमुख मानव स्वप्रतिजन के साथ चूहों के संक्रमण P450 (hCYP2D6) 2D6 व्यापक हैपेटाइटिस, और CYP2D6 एक तंतुमयता पीढ़ी द्वारा विशेषता autoimmune की मध्यस्थता जिगर की बीमारी के एक सतत रूप में टाइप 2 autoimmune हैपेटाइटिस परिणाम से पीड़ित रोगियों के सीरा द्वारा मान्यता प्राप्त साइटोक्रोम विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है.
Autoimmune hepatitis is a rare but life threatening autoimmune disease of the liver of unknown etiology1,2. In the past many attempts have been made to generate an animal model that reflects the characteristics of the human disease 3-5. However, in various models the induction of disease was rather complex and often hepatitis was only transient3-5. Therefore, we have developed a straightforward mouse model that uses the major human autoantigen in type 2 autoimmune hepatitis (AIH-2), namely hCYP2D6, as a trigger6. Type 1 liver-kidney microsomal antibodies (LKM-1) antibodies recognizing hCYP2D6 are the hallmark of AIH-27,8. Delivery of hCYP2D6 into wildtype FVB or C57BL/6 mice was by an Adenovirus construct (Ad-2D6) that ensures a direct delivery of the triggering antigen to the liver. Thus, the ensuing local inflammation generates a fertile field9 for the subsequent development of autoimmunity. A combination of intravenous and intraperitoneal injection of Ad-2D6 is the most effective route to induce a long-lasting autoimmune damage to the liver (section 1). Here we provide a detailed protocol on how autoimmune liver disease is induced in the CYP2D6 model and how the different aspects of liver damage can be assessed. First, the serum levels of markers indicating hepatocyte destruction, such as aminotransferases, as well as the titers of hCYP2D6 antibodies are determined by sampling blood retroorbitaly (section 2). Second, the hCYP2D6-specific T cell response is characterized by collecting lymphocytes from the spleen and the liver. In order to obtain pure liver lymphocytes, the livers are perfused by PBS via the portal vein (section 3), digested in collagen and purified over a Percoll gradient (section 4). The frequency of hCYP2D6-specific T cells is analyzed by stimulation with hCYP2D6 peptides and identification of IFNγ-producing cells by flow cytometry (section 5). Third, cellular infiltration and fibrosis is determined by immunohistochemistry of liver sections (section 6). Such analysis regimen has to be conducted at several times after initiation of the disease in order to prove the chronic nature of the model. The magnitude of the immune response characterized by the frequency and activity of hCYP2D6-specific T and/or B cells and the degree of the liver damage and fibrosis have to be assessed for a subsequent evaluation of possible treatments to prevent, delay or abrogate the autodestructive process of the liver.
पिछले अध्ययनों में, प्रयोगात्मक हैपेटाइटिस अक्सर केवल autoimmune जिगर की बीमारी के लिए क्षणिक और कई मौजूदा मॉडल एक नहीं बल्कि जटिल रोग शामिल प्रोटोकॉल (समीक्षा के लिए 3,5 देखना) पर निर्भर था. उदाहरण के लिए, कई मॉडल ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग लक्ष्य विशिष्ट एंटीजन व्यक्त है और adoptively 14,15 प्रतिजन विशेष ज्यादातर TCR ट्रांसजेनिक, टी कोशिकाओं लक्ष्य स्थानांतरित. अक्सर livertropic वायरस, बैक्टीरिया या परजीवी के साथ एक अतिरिक्त संक्रमण 16-18 रोग पैदा करने के लिए आवश्यक है. वैकल्पिक रूप से, 19 CYP2D6 लक्ष्य प्रतिजनों,, के लिए एन्कोडिंग प्लास्मिड डीएनए टीकाकरण हैपेटाइटिस प्रेरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. हालांकि, आईएल -12 के रूप में समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स, के लिए एन्कोडिंग प्लास्मिड के साथ एक अतिरिक्त टीकाकरण 20 की आवश्यकता है. दुर्भाग्य से, कुछ अपवादों के साथ 15,20 हेपेटाइटिस केवल क्षणिक है.
CYP2D6 6,21 मॉडल टी का उपयोग करता है एक सरल तरीकाबस एक, 7,8 AIH 2 में प्रमुख स्वप्रतिजन hCYP2D6 व्यक्त Adenovirus के साथ चूहों को संक्रमण से autoimmune हैपेटाइटिस प्रेरित ओ. CYP2D6 का एक adenovirus निर्माण के द्वारा डिलिवरी दोनों जिगर का एक सीधा लक्ष्यीकरण के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक स्थानीय सूजन है कि सहिष्णुता के टूटने को बढ़ावा देता है की गारंटी देता है. यह महत्वपूर्ण है लेकिन ध्यान रखें कि दोनों वायरस के रूप में अच्छी तरह से प्रशासन के मार्ग अनुमापांक इस मॉडल के लिए महत्वपूर्ण है. एक हाथ पर, विज्ञापन 2D6 एक प्रतिकृति की कमी वायरस है, इस प्रकार, वायरस की एक पर्याप्त उच्च अनुमापांक जिगर के भीतर प्रतिजन की एक महत्वपूर्ण राशि उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है. दूसरी ओर, बहुत अधिक अनुमापांक एक घातक तीव्र जिगर की विफलता में परिणाम हो सकता है. इसके अलावा, यह पहले से दिखा दिया है कि adenovirus के उच्च titers द्वारा चूहों के संक्रमण प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 22 के कार्यात्मक थकावट की ओर जाता है. हमारे मॉडल में, हम नसों और intraperitoneal संक्रमण का एक संयोजन का उपयोग किया क्रम में दोनों पुरानी सेलुलर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से घुसपैठ ext प्राप्तensive तंतुमयता. हमने देखा है कि अकेले नसों में संक्रमण अभी भी बड़े पैमाने पर सेलुलर घुसपैठ का कारण बनता है, लेकिन subcapsular क्षेत्र का कोई फाइब्रोसिस कि peritoneal intraperitoneal इंजेक्शन के कारण सूजन का संकेत कोलेजन की निरंतर subcapsular संचय (Hintermann और बप्तिस्मा तैयारी में पांडुलिपि) में शामिल किया जा सकता है. हालांकि, यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि मनाया यकृत तंतुमयता प्रतिजन विशिष्ट है, के बाद से हम विज्ञापन GFP या 23 विज्ञापन नियंत्रण के बराबर वायरस titers के साथ यकृत तारामय कोशिकाओं और कोलेजन बयान की सक्रियता का पता नहीं लगा था संक्रमण के बाद.
CYP2D6 मॉडल मानव AIH 1,2 की पुरानी लगातार सेलुलर घुसपैठ और जिगर तंतुमयता 6 द्वारा विशेषता हेपेटाइटिस जैसे कई पहलुओं को दर्शाता है. इसके अलावा, उच्च टिटर इसी तरह का मिलान विशिष्टता और LKM – 1 AIH – 2 रोगियों में पाया एंटीबॉडी के लिए 13 के प्रसार के साथ विरोधी CYP2D6 एंटीबॉडी की उपस्थिति पूर्व इंगित करता हैएक आम पुरानी autoimmune जेट की भावना. CYP2D6 AIH-2 में प्रमुख प्रतिजन है, लेकिन यह अधिक अक्सर प्रकार 1 AIH साथ रोगियों का निदान द्वारा मान्यता प्राप्त नहीं है. इसके अलावा, autoimmune एटियलजि के साथ अन्य जिगर प्राथमिक पैत्तिक सिरोसिस (PBC) या प्राथमिक sclerosing पित्तवाहिनीशोथ (पीएससी) के रूप में, रोगों से पीड़ित रोगियों, बानगी autoantibodies उत्पन्न अलग के जिगर autoantigens और उनके यकृत को विशिष्टता के साथ विभिन्न रोग छोटे पर केंद्रित विशेषताएं (PBC बताते हैं ) या बड़े (पीएससी) पित्त नलिकाएं. फिर भी, CYP2D6 मॉडल के immunopathogenic autoimmune यकृत रोग के दौरान होने वाली hepatocytes के autoimmune विनाश ड्राइव और संभव उपचारात्मक उपायों का मूल्यांकन करने के लिए बीमारी का इलाज करने के लिए प्रमुख खिलाड़ियों की पहचान के रूप में पुरानी यकृत सूजन प्रक्रियाओं में शामिल तंत्र का विश्लेषण करने के लिए अवसर प्रदान करता है.
The authors have nothing to disclose.
यह काम गेटे विश्वविद्यालय अस्पताल फ्रैंकफर्ट और यूसी के लिए जर्मन रिसर्च फाउंडेशन के अनुदान द्वारा समर्थित है
Name of the equipment | Company | Catalogue number | Comments |
23G needle | BD Biosciences | 300800 | |
27½G needle | VWR | 612-0151 | |
30½ G needle | BD Biosciences | 304000 | |
Alanine aminotransferase test strips (GPT/ALT) | Roche Diagnostics | 10 745 138 202 | |
Aspartate aminotransferase test strips (GOT/AST) | Roche Diagnostics | 10 745 120 202 | |
Anaesthesia Unit Univentor 400 | AgnTho’s | ||
Base molds, disposable 37x24x10 mm | VWR | 720-0208 | |
Cell strainer 70mm | VWR | 734-0003 | |
Cryostat | Leica | CM1850 UV | |
Heparinized capillary tubes | Fisher | 3123987 | |
Microscope slides Superfrost Plus | Menzel Gläser | J1800AMNZ | |
Microtainer SST tubes | BD Biosciences | 365951 | |
Microtiter plates, V-bottom | VWR | 391-1924 | |
Reflotron Plus | Roche Diagnostics | Determiniation of serum AST / ALT | |
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Rabbit anti-mouse anti-Collagen type I IgG, | Chemicon | AB765P | |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector (AXXORA) | VC-BA-1000-MC15 | |
FITC-conjugated anti mouse CD8a antibody | Southern Biotech | 1550-02 | |
PE-conjugated anti mouse IFNγ antibody | BD Biosciences | 554412 | |
PE-conjugated anti-mouse CD16/CD32 antibody (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | |
Aquatex | VWR | 1.08562.0050 | |
Avidin/Biotin Blocking kit | Vector (AXXORA) | VC-SP-2001-KI01 | |
Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
Collagenase IV | Sigma | C5138-100MG | |
DAB substrate kit 3’3’diaminobenzidine | Vector (AXXORA) | VC-SK-4100-KI01 | |
DNase | Sigma | DN-25 | |
Elite ABC Reagent | Vector (AXXORA) | VC-PK-7100-L050 | |
Eosin G/Y solution | Roth | X883.1 | |
Fetal calf serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | |
Isofluran | Forene | B506 | |
Meyer’s Hematoxylin solution | AppliChem | A4840,1000 | |
OCT Compound | Sakura Finetek Europe | 4583 | |
PBS-buffered formaldehyde 10% | Roth | A146.3 | |
Percoll | Amersham | 17-0891-01 | |
Roti-Histokit | Roth | 6638.1 | |
RPMI | Invitrogen | 61870 | |
Saponin from quillaja bark | Sigma | S7900 |