Infektion av möss med ett adenovirus som uttrycker den viktigaste humana autoantigen cytokrom P450 2D6 (hCYP2D6) som erkänns av sera från patienter som lider av typ 2 autoimmun hepatit resulterar i en ihållande form av autoimmun-medierad leversjukdom som kännetecknas av omfattande hepatit, fibros och generering av en CYP2D6 -specifikt immunsvar.
Autoimmun hepatit är en sällsynt men livshotande autoimmun sjukdom i levern av okänd etiologi 1,2. I de senaste många försök har gjorts för för att generera en djurmodell som återspeglar egenskaperna hos den mänskliga sjukdomen 3-5. Men i olika modeller induktion av sjukdomen var ganska komplex och ofta hepatit var bara övergående 3-5. Därför, har vi utvecklat en rättfram mus modell som använder det huvudsakliga humana autoantigen i typ 2 autoimmun hepatit (AIH-2), nämligen hCYP2D6, såsom en avtryckare 6. Typ 1 lever-njur-mikrosomala antikroppar (LKM-1)-antikroppar som känner igen hCYP2D6 är kännetecknande för AIH-2 7,8. Leverans av hCYP2D6 till vildtyp FVB eller C57BL / 6 möss var av en Adenovirus konstruktion (Ad-2D6) som garanterar en direkt leverans av utlösande antigenet till levern. Således genererar efterföljande lokal inflammation en bördig fält 9 för den efterföljande utvecklingen av autoimmunitet. En Combination av intravenös och intraperitoneal injektion av Ad-2D6 är den mest effektiva vägen för att inducera en långvarig autoimmun skada på levern (avsnitt 1). Här erbjuder vi ett detaljerat protokoll för hur autoimmun leversjukdom induceras i CYP2D6-modellen och hur de olika aspekterna av leverskada kan bedömas. Först serumnivåerna av markörer som visar hepatocyter förstörelse, såsom aminotransferaser, liksom titrarna av hCYP2D6 antikroppar bestämmas genom provtagning av blod retroorbitaly (avsnitt 2). Det andra anbringas det hCYP2D6-specifik T cellsvar som kännetecknas genom att samla in lymfocyter från mjälten och levern. För att få rena lever lymfocyter är levern perfusion av PBS via portalen ven (avsnitt 3), kokas i kollagen och renas över en Percoll gradient (avsnitt 4). Frekvensen av hCYP2D6-specifika T-celler analyseras av stimulering med hCYP2D6 peptider och identifiering av IFNy-producerande celler med flödescytometri (avsnitt 5). Tredje,cellulär infiltration och fibros bestäms av immunohistokemi av lever avsnitt (avsnitt 6). En sådan analys regimen måste utföras vid flera gånger efter initiering av sjukdomen i syfte att bevisa kroniska natur av modellen. Den magnitud av immunsvaret kännetecknas av den frekvensen och aktiviteten av hCYP2D6-specifika T och / eller celler B-och den grad av den leverskada och fibros ha som skall bedömas för en efterföljande utvärdering av möjliga behandlingar för att förhindra, försena eller upphäva de berörda autodestructive processen av levern.
I tidigare studier har experimentell hepatit ofta rapporteras vara bara övergående och många aktuella modeller för autoimmuna leversjukdom beror på en ganska komplex protokoll sjukdomar induktion (för översikter se 3,5). Till exempel flera modeller använder transgena möss som uttrycker specifika mål antigener och adoptivt överförs målantigenet-specifika, de flesta TcR-transgena och T-celler 14,15. Ofta en ytterligare en infektion med livertropic virus, bakterier eller parasiter som är nödvändigt för att inducera sjukdom 16-18. Alternativt DNA-vaccination med plasmider som kodar för målantigener, inklusive CYP2D6 19, används för att inducera hepatit. Emellertid är en ytterligare en vaccination med plasmider som kodar för pro-inflammatoriska cytokiner, såsom IL-12, erfordras 20. Tyvärr, med några få undantag 15,20 hepatit är bara övergående.
CYP2D6-modellen 6,21 använder en enkel metod to inducerar autoimmun hepatit genom att helt enkelt infektera möss med ett adenovirus som uttrycker hCYP2D6, den stora autoantigen i AIH-2 7,8. Leverans av CYP2D6 med ett adenovirus konstruktion garanterar både en direkt inriktning på levern samt en lokal inflammation som främjar nedbrytningen av tolerans. Det är viktigt att notera dock att både den viruset-titer såväl som den administrationssättet är avgörande för denna modell. Å ena sidan, är Ad-2D6 en replikation bristfällig-virus, sålunda, en tillräcklig hög titer av-virus är skyldig att generera en kritisk mängd antigen inuti levern. Å den andra sidan kan det vara alltför hög en-titer resultera i en dödlig akut leversvikt. Som tillägg, har det demonstrerats tidigare att infektion av möss genom höga titrar av adenoviruset leder till en funktionell utmattning av immunsvaret 22. I vår modell, använde vi en kombination av intravenös och intraperitonal infektion i syfte att erhålla både kronisk cellulär infiltration såväl som anknensive fibros. Vi har observerat att intravenös infektion sig fortfarande orsakar massiv cellulär infiltration, men ingen fibros i subkapsulära regionen, vilket tyder på att bukhinneinflammation till följd av intraperitoneal injektion kan vara inblandade i det kontinuerliga subkapsulär ansamling av kollagen (Hintermann & Christen, manuskript under utarbetande). Emellertid är det viktigt att notera att den observerade hepatisk fibros är antigen-specifik, eftersom vi inte hade detektera aktivering av celler hepatiska stellatceller och kollagen avsättningshastigheter efter infektion med lika stora virus-titrar av Ad-GFP-eller Ad-Control 23.
CYP2D6 Modellen speglar många aspekter av mänsklig AIH 1,2, såsom kronisk hepatit kännetecknas av ihållande cellulär infiltration och lever fibros 6. Som tillägg, indikerar närvaron av hög-antikroppnivåvärden-anti-CYP2D6-antikroppar med lik epitop specificitet och sprider sig 13 för att LKM-1-antikroppar funna i AIH-2 patienter den förhandsfinansieringsinne av en vanlig kronisk autoimmun reaktivitet. CYP2D6 är den största antigen i AIH-2, men det är inte erkänd av patienter som diagnostiserats med den mer frekventa typ 1 AIH. Dessutom kan patienter som lider av andra leversjukdomar med autoimmun etiologi, såsom primär biliär cirros (PBC) eller primär skleroserande kolangit (PSC), generera Hallmark autoantikroppar med specificitet till olika lever autoantigener och deras lever visar olika patologiska funktioner inriktning på små (PBC ) eller stora (PSC) gallgångar. Ändå erbjuder CYP2D6 modeller möjlighet att analysera immunopathogenic mekanismer involverade i kronisk leverskada inflammatoriska processer som inträffar under autoimmuna leversjukdomar, för att identifiera viktiga aktörer som driver den autoimmuna förstörelsen av hepatocyter och för att utvärdera möjliga terapeutiska insatser för att bota sjukdomen.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av Goethe Universitetssjukhuset Frankfurt och ett bidrag av den tyska Research Foundation till UC
Name of the equipment | Company | Catalogue number | Comments |
23G needle | BD Biosciences | 300800 | |
27½G needle | VWR | 612-0151 | |
30½ G needle | BD Biosciences | 304000 | |
Alanine aminotransferase test strips (GPT/ALT) | Roche Diagnostics | 10 745 138 202 | |
Aspartate aminotransferase test strips (GOT/AST) | Roche Diagnostics | 10 745 120 202 | |
Anaesthesia Unit Univentor 400 | AgnTho’s | ||
Base molds, disposable 37x24x10 mm | VWR | 720-0208 | |
Cell strainer 70mm | VWR | 734-0003 | |
Cryostat | Leica | CM1850 UV | |
Heparinized capillary tubes | Fisher | 3123987 | |
Microscope slides Superfrost Plus | Menzel Gläser | J1800AMNZ | |
Microtainer SST tubes | BD Biosciences | 365951 | |
Microtiter plates, V-bottom | VWR | 391-1924 | |
Reflotron Plus | Roche Diagnostics | Determiniation of serum AST / ALT | |
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Rabbit anti-mouse anti-Collagen type I IgG, | Chemicon | AB765P | |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector (AXXORA) | VC-BA-1000-MC15 | |
FITC-conjugated anti mouse CD8a antibody | Southern Biotech | 1550-02 | |
PE-conjugated anti mouse IFNγ antibody | BD Biosciences | 554412 | |
PE-conjugated anti-mouse CD16/CD32 antibody (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | |
Aquatex | VWR | 1.08562.0050 | |
Avidin/Biotin Blocking kit | Vector (AXXORA) | VC-SP-2001-KI01 | |
Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
Collagenase IV | Sigma | C5138-100MG | |
DAB substrate kit 3’3’diaminobenzidine | Vector (AXXORA) | VC-SK-4100-KI01 | |
DNase | Sigma | DN-25 | |
Elite ABC Reagent | Vector (AXXORA) | VC-PK-7100-L050 | |
Eosin G/Y solution | Roth | X883.1 | |
Fetal calf serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | |
Isofluran | Forene | B506 | |
Meyer’s Hematoxylin solution | AppliChem | A4840,1000 | |
OCT Compound | Sakura Finetek Europe | 4583 | |
PBS-buffered formaldehyde 10% | Roth | A146.3 | |
Percoll | Amersham | 17-0891-01 | |
Roti-Histokit | Roth | 6638.1 | |
RPMI | Invitrogen | 61870 | |
Saponin from quillaja bark | Sigma | S7900 |