Silke filmer är en ny klass av biomaterial lätt anpassningsbara för en uppsättning av biomedicinska tillämpningar. Den presenterade siden filmkultur systemet är mycket anpassningsbart till olika<em> In vitro</em> Analyser. Detta system innebär en biomaterial erbjudande design plattform<em> In vitro</em> Optimering innan direkt översättning till<em> In vivo</em> Modeller.
Silk filmer är lovande protein-baserade biomaterial som kan tillverkas med hög trohet och ekonomiskt inom ett forskningsområde laboratoriemiljö 1,2. Dessa material är önskvärda eftersom de besitter mycket kontrollerbar dimensionella och materialegenskaper, är biokompatibla och främja celladhesion, kan modifieras genom topografisk mönstring eller genom att kemiskt förändra ytan, och kan användas som en depå för biologiskt aktiva molekyler för närbesläktade läkemedelsavgivningssystem tillämpningar 3-8. Dessutom, silke filmer är relativt enkelt att skräddarsy, kan utformas för att upplösas inom minuter eller brytas ned med år in vitro eller in vivo, och är producera med den ytterligare fördelen av att vara transparent i naturen och är därför mycket lämplig för avbildningstillämpningar 9 – 13. Kulturen Systemet metoder som presenteras här är en skalbar metod för snabba bedömningar av cell-siden filmytaninteraktioner. Av särskilt intresse är användningen av ytan mönstrade siden filmer att studera skillnader i cell proliferation och svar från celler för anpassning 12,14. De seedade kulturerna odlades på både mikro-mönstrade och platta siden substrat film, och sedan bedömas genom time-lapse faskontrast avbildning, svepelektronmikroskopi, och biokemisk bedömning av metabolisk aktivitet och nukleinsyra innehåll. Sammanfattningsvis erbjuder silke filmen in vitro-odlingssystem en anpassningsbar experimentuppställning lämplig för studier av cellyts-växelverkningar på ett biomaterial substrat, som sedan kan optimeras och översätts sedan till in vivo-modeller. Observationer med hjälp av odlingssystemet som presenteras här används för närvarande för att hjälpa i allt från grundläggande cell interaktioner till medicinsk enhet design, och därmed är relevanta för ett brett spektrum av biomedicinska områden.
Användningen av regenererad siden filmer som substrat för cellodling har vunnit i popularitet under de senaste två decennierna på grund av omfattande karakterisering av materialegenskaper av detta protein och ökad förståelse av dess biomaterial användbarhet 3,8. Kulturen som beskrivs här är en ny in vitro-testsystem för att bedöma interaktioner cellytan på mönstrade siden filmen biomaterial substrat 7. Systemet gör det möjligt för en fördjupad analys av cellulära interaktioner över tiden som lätt kan antas för hög genomströmning datainsamling. Detta är till stor del aktiverat eftersom siden filmer har ett antal avstämbara biomaterial egenskaper som kan modifieras för att direkt påverka cellfunktionen 8,9,12, inklusive: kontroll av ytan mikro / nano-ytans topografi 7, olika ytor kemiska genom kovalent modifiering eller adsorption av biologiskt aktiva molekyler 13; robust mekanical fastigheter 15,16, kontroll av material hydrofilitet / hydrofobicitet 16, delen lastning av biologiska föreningar för frisläppande 4,8,17, och kontrollerad upplösning / enzymatiska priser nedbrytning genom kontroll av den sekundära strukturen (beta ark innehåll) 11,18,19 .
Insynen i siden filmer uppnås genom glödgning filmerna under en tid under vakuum i närvaro av vattenånga 7,15. Denna behandling tillvägagångssätt medger bildning av β ark sekundär struktur, befrämjade olöslighet av materialet i vatten samtidigt som minimal diffraktion av ljus 15. Denna öppenhet filmer är nyckeln för att direkt levande cell imaging som kan användas under ett antal avbildningsmetoder (dvs. brett fält och fluorescens) med valfritt antal mikroskop system 12,20. Förutom live-cell imaging, kan silke filmer lätt tas bort från ee kultur för att möjliggöra ytterligare fixering och analys. Således, den stora variation av direkta experimentella bedömningar som kan utföras på detta system är tillämpliga på en mängd olika celler / vävnader källor för många tekniska områden 3,8,9,12,13,21. De tidsförlopp avbildande resultat illustrerar hur realtid kultur data kan samlas in, och som ett exempel användes för att illustrera hur yttopografi påverkar cell-interaktioner. De representativa resultat visar hur silke film biomaterial kan användas för att stödja HCLE kulturtillväxt och är kan ändras på ett antal standard cellulär proliferation och metaboliska analyser (fig. 4). Dessutom är de kulturer fixerades och bearbetades för svepelektron avbildning eller andra protokoll (fig. 3).
Silk film substrat produceras i labbet med hög trohet, konsekvens och med relativt låg kostnad (Fig. 1). Detta möjliggör reproduciansvar för både kultur systeminstallation och experimentella resultat. Det har visats att vatten-glödgning bearbetning ger ett stabilt material silk filmen inom kultur som har definierat förstöras i väntan på koncentrationen av proteaser i lösning 2,15,22. Som ett resultat av dessa material får användas under en längre tid för långsiktig cellodling, eller förblir implanteras i månader eller år beroende på den fysiologiska plats 8. Dessutom har senare arbete visat att både proteinet struktur och materialegenskaper av vatten-glödgad silke filmer är konsekvent från parti till parti möjliggör reproducerbara kultur resultaten som visas genom olika mekaniska och biofysiska testmetoder 15,16. Dessutom har materialets yta visat stor trohet mellan film partier som indikeras av SEM, Atomic Force micrscopy (AFM) och cellkulturstudier {Lawrence: 2008wr, Omenetto: 2008tc, Bray: 2011kq} 7,23,24. Materialet stabiltet och konsistens är en viktig faktor för hur cellen kommer att avkänna odlingssubstratet genom de olika mechanotransduction vägar, och slutligen producera en önskad / oönskad cellulär respons 25,26.
Historiskt sett för odlingssubstrat, såsom vävnad som behandlas kultur plast eller glas, tillhandahålla adekvata substrat för cellvidhäftning. Emellertid är dessa material inte kan ändras för att ytterligare användbarhet in vivo. Det kan tänkas att en silk film biomaterial kan anpassas in vitro, och när experimentella förväntningar har uppnått anpassade filmen direkt kan översättas till en in vivo-modell. Sådan parade utformning mellan in vitro och in vivo experiment har en stor fördel för sådana implanterbara siden biomaterial över andra substrat som rutinmässigt används in vitro.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering från NIH K08EY015829, R21EY019561, R24EY015656, P41 EB002520 och R01 EY020856 Forskning kring att förebygga blindhet Award karriärrådgivning, och Tri-institutionella Stem Cell Initiative. HCLE cellinje som tillstånd av Dr Ilene Gipson. Författarna vill tacka Dr Aihong Liu vid Weill Cornell Medical College för henne tekniskt bistånd och vägledning med cellodling, Anthony Labissiere på sjukhuset för särskilda operationer för henne tekniskt bistånd med SEM avbildning, för vävnadsteknik Resource Center (TERC) på Tufts University för teknisk support med materialutveckling och Cornell Centrum för nanovetenskap och teknologi (CNF) för assistans vid kiselskivan tillverkning.
Material Name | Company | Catalogue Number |
Silk cocoons | Tajima Shoji Co., LTD. | NA |
PDMS monomer and cross-linker | Momentive | RTV615A 01P |
Sodium Carbonate | Sigma | S2127 |
Lithium Bromide | Sigma | 213225 |
Slide-A-Lyzer | Thermo Scientific | 66110 |
1 mL Syringe | Becton-Dickenson | 309602 |
Stainless steel washer | Superior Washer | 81610 |
24-well plate | VWR | 353047 |