에서 세포 외액의 Vampiric 절연<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
모델 생물<em> C. elegans</em> 수동 순환 시스템으로 pseudocoelomic 유체를 사용합니다. 이 유체의 직접 분석은 이전에 수 없었습니다. 여기에 직접 검정 세포 공간을에 소설 기법을 제시하고, 원칙 예제의 증거로 RNAi 반응하는 동안 조직 입을 신호를 사용합니다.
Abstract
유전자 다루기 쉬운 모델 생물 C. elegans의 성장과 작은 크기의 용이성, 그 짧은 세대 시간으로 활성화, 생물의 질문 무수히으로 통찰력을 제공하고 있습니다. 이 작은 크기는하지만 다른 모델 시스템에서 발견 된 기술적 접근 방법의 수를 금지하고 있습니다. 예를 들어, 포유류의 시스템과 식물의 접목 기술의 수혈은 순환 시스템 조성과 신호의 질문을 수 있습니다. 최근 직접 분석에 불가능 때까지 웜의 순환 시스템 pseudocoelom이 있습니다. 세포 신호 및 순환 시스템을 구성 C.의 질문에 답변하려면 elegans 연구원은 전통적으로 유전자 분석, 세포 / 조직 특정 구조, 그리고 모자이크 분석 해 나가고 있습니다. 이 기술은 세포 사이에 어떤 일이 일어나고 있는지를 추론 할 수있는 수단을 제공하지만, 세포 분자의 식별 및 특성에 보편적으로 적용되지 않습니다. 여기 NE을 제시직접 검정 C.의 pseudocoelomic 유체에 wly 개발 기술 elegans. 기술은 세포 외액의 볼륨을 높이기 위해 중 유전 적 또는 물리적 조작으로 시작됩니다. 이후 동물은 고급 밸런스 압력 제어 할 수있는 microinjection의 장비를 사용하여 vampiric 역방향 microinjection 기술을 받게됩니다. 세포 외액의 분리 후, 수집 된 유체가 다른 동물로 전송 또는 분자에 의해 assayed 할 수 있습니다. 이 기법의 효과를 입증하기 위해 우리는 체계적 RNAi 반응 동안 분석 세포 신호 분자, 긴 dsRNA의 특정 예를에 자세한 방법을 제시한다. 체계적 RNAi의 특성은 원리 예제의 증거이지만, 우리는 순환 시스템 조성과 신호의 질문에 다양한 대답을 적응 것으로이 기법을 참조하십시오.
Protocol
Discussion
여기 모델 유기체 C.에서 세포 외액의 절연 및 특성을 수있는 새로운 방법을 발표 elegans. 기술은 세포 외액 자신의 총 볼륨을 높이기 위해 기증 웜의 유전자 또는 물리적 조작을 시작합니다. 세포 외액은 다음 수정 microinjection 기술을 사용하여 절연하고 있습니다. 웜은 절차를 수행하는 동안 여전히 벌레를 잡아 건조 아가로 오스 패드를 사용하여 microinjection에 장착되어 있습니다. 패?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 헌터 연구소의 협력 자연을 인정하고,이 기술의 개발이 가능하고, 즐거운 한 도움이 토론과 도움에 감사합니다. 나이젤 Delaney와 웜과 박테리아 변종에 대한 Caenorhabditis 유전학 센터를 감사드립니다. 이 작품은 건강의 국립 연구소 CPH에 GM089795 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Day | Worm Prep | Material Prep |
| -7 or prior | Maintain clean, well fed clr-1(e1745) and N2 worms | Make injection pads, NGM plates, NGM +Carb/IPTG plates, OP50 LB stock |
| -6 | Streak out RNAi food on LB + Carb | |
| -5 | Inoculate 3 mL overnight with RNAi food | |
| -4 | Move embryos to RNAi plate | Seed RNAi plate |
| -3 | ||
| -2 | ||
| -1 | ||
| 0 | Shift worms to 25 for 4 hours | Make assay plates |
| Move worms to clean NGM plates | ||
| Vampiric transfer | ||
| Recover recipient | ||
| +1 | Remove transfer recipient | |
| +2 | Score Progeny |
Table 1. Material preparation timeline.
| Equipment | Company | Catalogue number |
| Picoliter Pressure Injector | Warner Instruments | 65-0001 (PLI-100) |
| Flaming/Brown micropipette Puller | Sutter Instruments | P97 |
| Axiovert 200 | Zeiss | |
| Reagents | ||
| Mineral Oil | EM Science | MX1560-1 |
| 22×50 no 1½ Cover Glass | Corning | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precisions Instruments | 1B100F-4 |
| Sodium Hypochlorite Solution (5% available Chlorine) | J.T. Baker | 9416-01 |
| C. elegans and Bacterial Strains | ||
| clr-1(e1745)II 9 | The Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | CB3241 |
| glp-1 RNAi vector 10 | Source Bioscience (Ahringer Feeding Library) | F02A9.6 |
| pal-1 RNAi vector11 | pHC187 | |
| OP50-GFP 5 | The Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50-GFP |
| YFP E. coli 4 | MC4100-YFP | |
Table 2. Specific reagents and equipment.
Referências
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