Ex vivo Mimicry for normale og unormale menneskelige hematopoiese
Summary
Et 3D dyrkningssystem for hematopoiese er beskrevet under anvendelse af humant navlestrengsblod og leukæmiske knoglemarvsceller. Fremgangsmåden er baseret på anvendelsen af en porøs syntetisk polyurethan skelet overtrukket med ekstracellulære matrix-proteiner. Dette skelet kan tilpasses til at rumme en lang række celler.
Abstract
Hæmatopoietiske stamceller kræver en unik mikromiljø for at opretholde blodlegemer dannelse 1 knoglemarven (BM) er en kompleks tredimensional (3D) væv, hvori hæmatopoiese reguleres ved rumligt arrangeret cellulære mikromiljøer betegnet nicher 2-4. Organiseringen af BM nicher er afgørende for funktionen eller dysfunktion af normal eller ondartet BM 5. Derfor er en bedre forståelse af in vivo mikromiljø ved hjælp af et ex vivo mimicry ville hjælpe os med at belyse de molekylære, cellulære og microenvironmental determinanter for leukemogenesis 6.
Dag, er hæmatopoietiske celler dyrket in vitro i todimensionale (2D) vævskulturkolber / brønd plader 7, som kræver enten co-kultur med allogen eller xenogene stromale celler eller tilsætning af exogene cytokiner 8. Disse betingelser er kunstige og adskiller sig fra in vivo </em> mikromiljø i, at de mangler 3D cellulære nicher og udsætte cellerne til unormalt høje cytokinkoncentrationer hvilket kan resultere i differentiering og tab af pluripotency 9,10.
Heri, præsenterer vi en hidtil ukendt 3D knoglemarv kultur, der simulerer in vivo-3D vækst og understøtter multilineage hæmatopoiese i fravær af exogene vækstfaktorer. Den meget porøse stillads anvendes i dette system er fremstillet af polyurethan (PU), letter høj tæthed cellevækst over et større specifikt overfladeareal end det konventionelle monolagskultur i 2D 11. Vores arbejde har vist, at denne model understøttede væksten af humant navlestrengsblod (CB) mononukleære celler (MNC) 12 og primære leukæmiske celler i fravær af exogene cytokiner. Denne hidtil ukendte 3D mimicry tilvejebringer en platform for udviklingen af et humant eksperimentel model til at studere hæmatopoiese og til at undersøge hidtil ukendte behandlinger for leukæmi.
Protocol
Discussion
Den ex vivo 3D-kultur-systemet præsenteres her, giver os mulighed for at etablere en 3D biomimetik af hæmatopoiese at rekapitulerer den oprindelige BM arkitektur og cellulær fænotype uafhængig af eksogene cytokiner. 3D-modellen tilvejebringer strukturen og mikromiljøet som muliggør normal og unormal hæmatopoietiske celler til at proliferere under betingelser svarende til dem, der findes in vivo.
Udvælgelsen af det polymere skelet materiale var et kritisk trin…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af Richard Thomas Leukæmi fonden, Lady Tata Memorial Trust, Northwick Park Hospital Leukæmi Research Trust Fund og National Institute of Health Research (NIHR), England.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue No |
| Dioxan | Invitrogen | D20,186-3 |
| PBS | Gibco | 14190-094 |
| IMDM | Invitrogen | 12440-053 |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 |
| MTS | Promega | G3580 |
| Glutaraldehyde | Fluka Biochemika | 49624 |
| Wright-Giemsa | Sigma-Aldrich | WG32 |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10108-165 |
| CD71 | Santa Cruz Biotechnology | sc-32272 |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 |
| CD45-FITC | BD Pharmigen | 74895 |
| CD71-PE | BD Pharmigen | 555537 |
| CD235a-PE-Cy5 | BD Pharmigen | 555570 |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S-8032 |
Referências
- Orkin, S., Zon, L. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Spradling, A., Drummond-Barbosa, D., Kai, T. Stem cells find their niche. Nature. 414, 98-104 (2001).
- Panoskaltsis, N., Mantalaris, A., Wu, D. Engineering a mimicry of bone marrow tissue ex vivo. J Biosci. Bioeng. 100, 28-35 (2005).
- Lo Celso, C. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Mantalaris, A., Bourne, P., Wu, J. Production of human osteoclasts in a three-dimensional bone marrow culture system. Biochem. Eng. J. 20, 189-196 (2004).
- Placzek, M. Stem cell bioprocessing: fundamentals and principles. J. R. Soc. Interface. 6, 209-232 (2009).
- Dexter, T., Testa, N., Prescott, D. . Methods in Cell Biology. 14, 387-405 (1976).
- Piacibello, W. Differential growth factor requirement of primitive cord blood hematopoietic stem cell for self-renewal and amplification vs proliferation and differentiation. Leukemia. 12, 718-727 (1998).
- Yoshida, T., Takagi, M. Cell processing engineering for ex vivo expansion of hematopoietic cells: a review. Biochemical Engineering Journal. 20, 99-106 (2004).
- Lim, M. Intelligent bioprocessing for haemotopoietic cell cultures using monitoring and design of experiments. Biotechnol. Adv. 25, 353-368 (2007).
- Mortera-Blanco, T., Mantalaris, A., Bismarck, A., Panoskaltsis, N. The development of a three-dimensional scaffold for ex vivo biomimicry of human acute myeloid leukaemia. Biomaterials. 31, 2243-2251 (2010).
- Mortera-Blanco, T., Mantalaris, A., Bismarck, A., Aqel, N., Panoskaltsis, N. Long-term cytokine-free expansion of cord blood mononuclear cells in three-dimensional scaffolds. Biomaterials. 32, 9263-9270 (2011).
- Safinia, L., Datan, N., Hohse, M., Mantalaris, A., Bismarck, A. Towards a methodology for the effective surface modification of porous polymer scaffolds. Biomaterials. 26, 7537-7547 (2005).
