הדור של תרבויות רפסודות Organotypic של קרטינוציטים אדם מן המעלה הראשונה
Summary
<em> במבחנה</em> שיטת לחקות<em> In vivo</em> בידול האפיתל המתואר. וירוסים רבים למקד לתאי האפיתל במסגרת מחזור החיים הנגיפי שלהם, שיטה זו מספקת אמצעי לבחינת וירוס: אינטראקציות מארחים יותר מקרוב דומה לזו המתרחשת<em> In vivo</em>. טכניקה זו ניתן להשתמש עם קרטינוציטים ראשוניים, שורות תאים שהוקמו, כמו גם נורמלי או חולה רקמות ביופסיה.
Abstract
פיתוח organotypic תרבויות רפסודות אפיתל סיפקה לחוקרים עם ויעיל במערכת במבחנה כי משחזר בנאמנות בידול אפיתל. ישנם שימושים רבים עבור מערכת זו. למשל, היכולת לגדול תלת ממדי תרבויות רפסודות organotypic של קרטינוציטים הייתה ציון דרך חשוב במחקר של וירוס הפפילומה האנושי (HPV) 1. מחזור החיים של HPV הוא קשור קשר הדוק בידול של האפיתל הקשקשי 2. Organotypic תרבויות רפסודות אפיתל כפי שתואר כאן לשחזר את כל מחזור החיים וירוס הפפילומה, כולל ייצור וירוס 3,4,5. בנוסף, אלה תרבויות רפסודות התערוכה נגעים שומות דומות לאלה שנצפו על זיהום vivo עם HPV. לכן מערכת זו יכולה לשמש גם כדי ללמוד סרטן תאים אפיתל, כמו גם את ההשפעה של תרופות על התמיינות תאים אפיתל בכלל. פותח במקור על ידי Asselineau ו Prunieras <sלמעלה> 6 ו שונה על ידי Kopan et al. 7, התרבות organotypic אפיתל מערכת רפסודה התבגר לתוך המודל, בכלל התרבות קל יחסית, הכוללת את הצמיחה של תאים על קולגן המתחבר שמרו על הממשק אוויר נוזלי (איור 1 א). במשך 10-14 ימים, התאים לרבד להבדיל, ויצרו אפיתל בעובי מלא שמייצר בידול ספציפיים cytokeratins. רפסודות שנקטפו ניתן לבדוק בהיסטולוגיה, כמו גם על ידי שיטות מולקולריות ביוכימיים סטנדרטיים. במאמר זה, אנו מתארים שיטה לייצור של תרבויות הרפסודה של קרטינוציטים אדם מן המעלה הראשונה. באותה טכניקה ניתן להשתמש שהוקמו שורות תאים אפיתל, והוא יכול בקלות להיות מותאם לשימוש עם רקמות אפיתל מ ביופסיות נורמלי או חולה 8. וירוסים רבים היעד או אפיתל עורית או הרירית כחלק ממעגל החיים שלהם replicative. בשנים האחרונות, את הכדאיות של שימוש כת רפסודה organotypicures כשיטה של לימוד וירוסים המארחות אינטראקציות סלולריים הוכח על herpesviruses כמה, כמו גם adenoviruses, parvoviruses ו poxviruses 9. תרבויות רפסודות Organotypic ולכן יכול להיות מותאם לבחון הפתוגנזה ויראלי, הם האמצעי היחיד לבחון סוכני נגיפים חדשים עבור אותם וירוסים שאינם לעיבוד של שורות תאים קבע.
Protocol
Discussion
המתואר כאן שיטה, שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד בידול אפיתל בכלל, אבל יכול גם להיות מותאם בקלות ללמוד הפתוגנזה ויראלי, כמו גם את היעילות של הרפוי פוטנציאליים. וירוסים רבים למקד לתאי האפיתל או כאתר העיקרי של זיהום, כמו במקרה של HPV, או בשלב מסוים במחזור החיים ויראלי, כמו herpesvir…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות סאלי רוברטס (אוניברסיטת בירמינגהם, בירמינגהם בבריטניה) מתנה סוג של נוגדנים E1E4. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם המכון הלאומי לסרטן (4R00CA137160-03).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog number |
| Rat Tail Collagen type 1 (4-5mg/ml) | BD Biosciences | 354236 |
| DMEM without NaHC03 | Invitrogen | 12100-061 |
| NaHC03 | Sigma | S5761 |
| Hepes | Calbiochem | 391338 |
| Stainless Steel metal grids | Williams and Mettle Co. | CR-03063-040-100-S |
| E medium11 | ||
| Epidermal Growth Factor | BD Biosciences | 354010 |
Referências
- Andrei, G., Duraffour, S., VandenOord, J., Snoeck, R. Epithelial raft cultures for investigations of virus growth, pathogenesis and efficacy of antiviral agents. Antiviral Research. 85, 431-449 (2010).
- Asselineau, D., Prunieras, M. Reconstruction of ‘simplified’ skin: control of fabrication. The British Journal of Dermatology. 111, 219-222 (1984).
- Bodily, J., Alam, S., Chen, H., Meyers, C. . Organotypic epithelial raft cultures and the study of the natural history of human papillomavirus. , (2006).
- Cheng, S., Schmidt-Grimminger, D. C., Murant, T., Broker, T. R., Chow, L. T. Differentiation-dependent up-regulation of the human papillomavirus E7 gene reactivates cellular DNA replication in suprabasal differentiated keratinocytes. Genes & Development. 9, 2335-2349 (1995).
- Dollard, S. C., Wilson, J. L., Demeter, L. M., Bonnez, W. R., Reichman, C., Broker, T. R., Chow, L. T. Production of human papillomavirus and modulation of the infectious program in epithelial raft cultures. OFF. Genes & Development. 6, 1131-1142 (1992).
- Frattini, M. G., Lim, H. B., Laimins, L. A. In vitro synthesis of oncogenic human papillomaviruses requires episomal genomes for differentiation-dependent late expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 3062-3067 (1996).
- Kopan, R., Traska, G., Fuchs, E. Retinoids as important regulators of terminal differentiation: examining keratin expression in individual epidermal cells at various stages of keratinization. The Journal of Cell Biology. 105, 427-440 (1997).
- Longworth, M. S., Laimins, L. A. Pathogenesis of human papillomaviruses in differentiating epithelia. Microbiology and Molecular Biology Review. 68, 362-372 (2004).
- Meyers, C., Frattini, M. G., Hudson, J. B., Laimins, L. A. Biosynthesis of human papillomavirus from a continuous cell line upon epithelial differentiation. Science. 257, 971-973 (1992).
- Wilson, R., Laimins, L. A. . Differentiation of HPV-Containing Cells Using Organotypic Raft Culture or Methylcellulose. , 119-119 (2006).
- zur Hausen, H. Papillomavirus infections–a major cause of human cancers. Biochimica et Biophysica Acta. 1288, F55-F78 (1996).
