Method Article

O Ex vivo Preparação microvasos isolada esquelético de Investigação da reatividade vascular

DOI:

10.3791/3674

⸱

April 28th, 2012

 ,  , 
1Department of Physiology and Pharmacology, Center for Cardiovascular and Respiratory Sciences, West Virginia University

In This Article

Summary

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Um Ex vivo é descrita para o isolamento das maiores grácil arteríolas musculares de resistência para interrogatório de ambas as respostas vasculares aos estímulos vasoativos e na avaliação de propriedades estruturais básicas via mecânica da parede passivos.

Abstract

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A preparação de microvasos isolado é uma preparação ex vivo que permite a análise das diferentes contribuições de factores que o diâmetro dos vasos de controlo, e assim, a resistência de perfusão 1-5. Esta é uma preparação clássica experimental que foi, em grande medida, inicialmente descrita por Uchida et al. De 15 há várias décadas. Esta descrição inicial serviu de base para as técnicas que foi amplamente modificado e melhorado, principalmente no laboratório do Dr. Brian Duling da Universidade de Virginia 6-8, e nós apresentamos uma abordagem atual nas páginas seguintes. Esta preparação irá referir-se especificamente à arteríola gracilis num rato como o microvasos de escolha, mas a preparação de base pode facilmente ser aplicado aos recipientes isolados a partir de quase qualquer outro tecido ou órgão em várias espécies 9-13. Mecânico (ie, dimensional) alterações no microvasos isolado pode ser facilmente avaliadaem resposta a uma ampla gama de fisiológico embora ex (por exemplo, pressão, hipóxia intravascular, ou cisalhamento) ou desafios farmacológicos, e pode fornecer uma visão em elementos mecanicistas compreendendo respostas integrados em um intacto, in vivo de tecidos,. O significado deste método é que ele permite uma manipulação fácil das influências sobre a regulação integrado de diâmetro microvascular, enquanto também permite que para o controlo de muitas das contribuições a partir de outras fontes, incluindo a pressão intravascular (miogênica), inervação autonômica, hemodinâmica ( por exemplo, estresse, cisalhamento), disfunção endotelial, estímulos dependentes ou independentes, hormonais e influências parenquimatosas, para fornecer uma lista parcial. Sob condições experimentais adequadas e com metas apropriadas, este pode servir como uma vantagem sobre in vivo ou in situ de tecidos de órgãos / preparações, que não permitem prontamente para o controlo fácil do mais amplos variáveis ​​sistémicas.

A malimitação jor desta preparação é essencialmente a conseqüência de suas forças. Por definição, o comportamento destes navios está sendo estudada sob condições em que muitos dos contribuintes mais significativos para a regulação da resistência vascular tenham sido removidos, incluindo neural, humoral, metabólicas, etc Como tal, o investigador deve ser advertido para evitar o excesso de interpretação e extrapolação dos dados que são coletados utilizando esta preparação. A outra área significativa de preocupação em relação a esta preparação é que ele pode ser muito fácil de danificar os componentes celulares, tais como o revestimento endotelial ou o músculo liso vascular, tal fonte que variável de erro pode ser introduzido. É fortemente recomendada que o investigador indivíduo utilizar medições adequadas para assegurar a qualidade da preparação, tanto no início da experiência e periodicamente durante todo o curso de um protocolo.

Protocol

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1. Antes da experiência

  1. Antes da experiência dias, os tubos capilares de vidro de dimensões apropriadas para a estação são puxados para micropipetas (quer seja um puxador horizontal ou vertical pode ser utilizado). O diâmetro da ponta pode ser facilmente ajustado dependendo do navio a ser isolado, embora geralmente usamos uma gama de diâmetros entre 50-150 uM. Estes são então dobrados para a configuração apropriada para o aquecimento de microvasos estação seguinte sobre uma chama de butano. Dicas micropipeta são fisicamente quebrado com o diâmetro aproximado (com pinça fina) para o microvascular em questão e pode chão ou polido para as conformações apropri....

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Discussion

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O protocolo apresentado descreve a canulação remoção de isolamento, e uma dupla de microvasos músculo esquelético, embora esta técnica geral, pode ser facilmente aplicada a maior parte dos tecidos. Para o manuscrito atual, o termo "arteríola" tem sido usado pelos autores para descrever um navio resistência variando entre 70-120 m de diâmetro em tom de descanso ativo, que é também um contributo importante para a regulação da resistência de perfusão de um órgão ou de tecido.

Com algu.......

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Disclosures

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Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgements

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Este trabalho foi financiado pela American Heart Association (EIA 0740129N) e T32 NIH HL90610.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagentes e Equipamentos Companhia Comentários / Catálogo #
Câmara navio Personalizado Dave Eick (MCW)
Banho de água aquecida circulação PolyScience e Haake Haake DC 10
Pipetas Frederick Haer & Co. Tubulação capilar 2,0 milímetros OD x 1,0 mm ID (27-33-1)
Monitor de Pressão Instrumentos de precisão do mundo
Reservatório de Água Jacketed Personalizado
Fonte de luz externa Instrumentos de precisão do mundo Novaflex
Extrator pipeta Microdados Instruments PMP102 micropipeta Puller
Comple completomento de instrumentos cirúrgicos Belas Ferramentas Ciência Dumont
Ultra pinça fina Belas Ferramentas Ciência Inox # 5
Fio de sutura de seda Ethilon # 10-0 ou 9-0
Microscópio estéreo Olimpo Olympus SZ-11
Analógicas Calipers Vídeo Boeckeler Via Controller (Via-100)
Câmera de alta resolução analógica Panasonic GP-MF 602
Tanque de oxigênio Regional Balanço de nitrogênio de 21% e 5% CO 2 balanço de nitrogênio
Tubulação Tygon
Escorra bomba Cole Parmer Instrument Co.
Modificados PSS Rato Ver receita abaixo
PSS relaxante Van Breemen de Ver receita abaixo

Tabela 1. Uma lista dos componentes principais de configuração isolado de microvasos estação apresentados nas Figuras.

Receita PSS Modificado Rato Para fazer dois litros de PSS 20X estoque Salt (2L) 20X depósito (2L)
NaCl 278,0 g
KCl 14,0 g
MgSO4-7H 2 ó 11,5 g
CaCl2-H2O 9,4 g
de NaHCO3 80,8 g
EDTA 0,4 g
NaH 2 PO 4 0,28 g
Glicose 1,98 g
20x estoque Sal 100 mL
20x depósito 100 mL
Água destilada 1800 mL

Tabela 2. Receita para solução de sal de padrão fisiológico (PSS) utilizado nos protocolos microvascular tumoral isolados.

Comentários sobre Receita: Faça 2 L de Banco de sal e 2 L de depósito. Estes cum ser refrigerado quando não estiverem sendo usados, mas agitá-los bem e, muitas vezes antes de preparar PSS. Os ingredientes adicionais são adicionados no momento da preparação de PSS finais.

PSS relaxante Van Breemen de Para fazer 2 litros de PSS 20X estoque Salt (1L) 20X depósito (1L)
NaCl 107,4 g
KCl 7,0 g
MgSO4-7H 2 ó 5,76 g
MgCl 2-6H 2 ó 81,32 g
De NaHCO3 40,4 g
EDTA 0,2 g
EGTA 15,22
NaH 2 PO 4 0,28 g
Glicose 1,98 g
20x estoque Sal 100 mL
20x depósito 100 mL
Água destilada 1800 mL

Tabela 3. Receita para solução Van Breemen do sal relaxante fisiológica (PSS) utilizado nos protocolos microvascular tumoral isolados sob condições de tom activa zero.

Comentários sobre Receita: Faça 1 L de Banco de sal pornd L 1 de depósito. Estes podem ser refrigerado quando não estiverem sendo usados, mas agitá-los bem e, muitas vezes antes de preparar PSS. Os ingredientes adicionais são adicionados no momento da preparação de finais PSS relaxantes.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goodwill, A. G., Frisbee, S. J., Stapleton, P. A., James, M. E., Frisbee, J. C. Impact of Chronic Anticholesterol Therapy on Development of Microvascular Rarefaction in the Metabolic Syndrome. Microcirculation. , 1-18 (2009).
  2. Goodwill, A. G., James, M. E., Frisbee, J. C.

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Isolated Microvessel PreparationEx Vivo Vascular ReactivityMicrovessel Cannulation TechniqueVessel Diameter MeasurementPhysiological Salt SolutionSurgical Microvessel IsolationIntravascular Pressure ChallengeEndothelial Function AssessmentVascular Smooth Muscle ToneMicrovascular Perfusion Resistance

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