<em> ड्रोसोफिला</em> अंडा कक्ष mRNA के स्थानीयकरण के तंत्र के अध्ययन के लिए एक शानदार मॉडल है. आदेश में गतिशील घटनाओं है कि स्थानीयकरण की प्रक्रिया पिन पर कब्जा करने के लिए, जीवित ऊतक के तेजी से उच्च संकल्प इमेजिंग की आवश्यकता है. यहाँ, हम विच्छेदन और न्यूनतम विघटन के साथ जीना नमूनों की इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं.
लाइव सेल इमेजिंग ड्रोसोफिला मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया लिए अक्ष विनिर्देश, सेल भेदभाव और 1 organogenesis जैसे विषयों की जांच के ऊतकों की एक संख्या लागू करने के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है. प्रयोगात्मक नमूने की तैयारी सही एक महत्वपूर्ण है, अक्सर उपेक्षित कदम है. तैयारी का लक्ष्य शारीरिक प्रासंगिकता को सुनिश्चित करने के लिए इष्टतम इमेजिंग की स्थिति की स्थापना की है. ऊतक करने के लिए व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए, यह निर्जलीकरण, hypoxia, overheating या मध्यम 2 गिरावट से बचने के लिए महत्वपूर्ण है.
ड्रोसोफिला अंडा कक्ष संबंधित प्रश्नों की जांच, लेकिन शरीर patterning के, mRNA के स्थानीयकरण और cytoskeletal 3,4 संगठन के लिए सीमित करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित प्रणाली है. प्रारंभिक और मध्य मंच अंडा कक्षों के लिए, हेलोकार्बन तेल में बढ़ते अस्तित्व के लिए अच्छा है कि यह ऑक्सीजन की मुफ्त प्रसार की अनुमति देता है, निर्जलीकरण और hypoxia को रोकता है और माइक्रोस्कोपी के लिए शानदार ऑप्टिकल गुण है. Imफ्लोरोसेंट प्रोटीन की उम्र बढ़ने, अंडा कक्ष या लेबल शाही सेना, प्रोटीन या 5-7 एंटीबॉडी के शारीरिक इंजेक्शन में transgenes की शुरूआत के माध्यम से संभव है. उदाहरण के लिए, पशुओं के जीनोम को MS2 constructs के अलावा 8 oocyte में mRNAs का वास्तविक समय अवलोकन के लिए सक्षम बनाता है. इन constructs MS2 जीवाणुभोजी अपने कोट प्रोटीन के साथ 9 शाही सेना स्टेम पाश बातचीत के उपयोग के माध्यम से mRNA की vivo लेबलिंग के लिए अनुमति देते हैं.
यहाँ, हम के रूप में महिला ड्रोसोफिला से व्यक्तिगत ovarioles और अंडे कक्षों अलग रूप में अच्छी तरह से अंडाशय के निष्कर्षण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. में ड्रोसोफिला oogenesis देखते एलन सी. (1993, 2009 में reprinted) Spradling 10 विस्तृत विवरण के लिए.
लाइव सेल इमेजिंग वास्तविक समय में सेलुलर प्रक्रियाओं की जांच के लिए एक शक्तिशाली परख है. सरल उज्ज्वल क्षेत्र अवलोकन के अलावा, लेबल फ्लोरोसेंट प्रोटीन और ब्याज की RNAs के अलावा कई सफलताओं के लिए नेतृत्व किया है. यहाँ हम इमेजिंग व्यक्ति रहने वाले oocytes कि आनुवंशिक और जैव रासायनिक assays के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है के लिए एक प्रोटोकॉल रेखांकित किया है.
इस प्रोटोकॉल में, हम भी समझा कैसे प्रयोगात्मक इंजेक्शन द्वारा रहने वाले oocytes में हेरफेर. इंजेक्षन सामग्री के लिए परख फ्लोरोसेंट लेबल शाही सेना संश्लेषित प्रत्यक्ष शाही सेना (गेंद और डेविस, अप्रकाशित) स्थानीयकरण और एंटीबॉडी कि 6 प्रोटीन के समारोह को बाधित करने के लिए एक माध्यमिक संरचना की क्षमता इन विट्रो सहित कई संभावनाएं हैं. भविष्य के काम की संभावना अन्य लेबलिंग घटकों और रहने वाले oocytes आणविक तंत्र का परीक्षण किया जा करने के लिए सक्षम करने के लिए सेलुलर तंत्र की शुरूआत देखेंगे.
टी "> और ऊतक की व्यवहार्यता और स्वास्थ्य के संरक्षण आवश्यक है जब जीवित कोशिकाओं के साथ काम कर रहा है. इस प्रोटोकॉल में, हम बाहर कदम है कि अंडा कक्ष के तनाव के लिए नेतृत्व कर सकते हैं की एक संख्या बिंदु उदाहरण के लिए तेल इमेजिंग के लिए बेहतर होने के बावजूद, तेल में विस्तारित संस्कृति अंडा कक्ष पर तनाव का नेतृत्व यह आसानी से परमाणु आकारिकी और स्थिति, oocyte झिल्ली है कि विकृत छाला और तनाव के तहत (Figure7F चित्रा 7E (निर्बल) की तुलना परीक्षण करके किया जा सकता है उज्ज्वल क्षेत्र जोखिम के तहत निगरानी कर सकते हैं. ( ) पर बल दिया) स्टेज 9 अंडा कक्षों के शाही सेना स्थानीयकरण और कई घंटे से अधिक सीमा सेल 12 प्रवास दिखाने हालांकि, एक मंच के 7/8 अंडे कक्ष हेलो कार्बन तेल में बीमार प्रभाव से हटा दिया जा रहा है अंडाशय के लगभग 40 मिनट के बाद प्रदर्शन शुरू हो जाएगा. महिला. स्वर्गीय चरण अंडा कक्षों, 14 से 11 मंच, सामान्य रूप से या इन 13 चरणों में कूप कोशिकाओं से अंडे का खोल के स्राव के कारण तेल जलीय मीडिया में विकसित कर सकते हैं यह रेपो किया गया है.में rted कि इंसुलिन के जलीय कीट मध्यम अलावा 6 से 14 घंटे और germaria 14 15 घंटे के लिए चरण 9 oocytes बनाए रखने कर सकते हैं. सभी मामलों में, अंडा कक्ष की आक्रामक चालों से परहेज किया जाना चाहिए क्योंकि यह oocytes जोर दिया है और इसकी व्यवहार्यता को कम कर देता है. इमेजिंग अंडा कक्षों कम और देखभाल लेने के इलाज के प्रत्येक धीरे इष्टतम व्यवहार्यता सुनिश्चित करने का सबसे अच्छा तरीका है.The authors have nothing to disclose.
यह काम एक वेलकम ट्रस्ट वरिष्ठ रिसर्च मैं डेविस फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया.
Tools used in dissection should be clean but do not need to be autoclaved. Wipe tools with ETOH and allow them to dry before beginning.
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Microscope- DeltaVision | Applied Precision | DC-CORE | |
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Burleigh PCS-5000 series, TS-5000-300 | http://www.ldgi-burleigh.com/ (Formerly Exfo) |
Injection apparatus | Tritech Research, Inc. 2961 Veteran Ave Los Angeles, CA 90064 |
MINJ-1 | Modified with a holder to take Eppendorf Femptotips |
Injection needle | Eppendorf Sterile Femtotips I and II | 930000043 | Different tips are better for different applications |
Loading tips 20μl | Eppendorf | 5242956.003 | |
Dry active yeast | Fleischmann’s Yeast | #2192 |