En beskrivning av de metoder som används för att konvertera en HP DeskJet 500 skrivare till en bioprinter. Skrivaren är kapabel att behandla levande celler, vilket orsakar övergående porer i membranet. Dessa porer kan utnyttjas för att införliva små molekyler, inklusive fluorescerande G-aktin, i de tryckta celler.
Bioprinting har ett brett spektrum av tillämpningar och betydelse, inklusive tissue engineering, direkta cellterapi ansökan och Biosensor mikrofabrikation. 1-10 har nyligen termisk bläckstråleskrivare också använts för gen transfektion. Visades 8,9 Den termiska bläckstråleskrivare tryckprocessen temporärt störa cellmembranen utan att påverka cellernas livskraft. De transienta porerna i membranet kan användas för att introducera molekyler, vilka annars skulle vara för stora för att passera genom membranet, in i cellens cytoplasma. 8,9,11
Det program som visas här är användningen av termiska bläckstråleutskrift för inkorporering av fluorescensmärkta G-aktin-monomerer in i celler. Fördelen med att använda termisk bläckstråleskrivare, för att injicera molekyler in i celler är att tekniken är relativt godartad till celler. 8, 12 Cell-livsdugligheten efter tryckning har visat sig vara liknande standardcell PLAting metoder 1,8. Dessutom kan bläckstråleskrift tusentals celler i minuter, vilket är mycket snabbare än manuell mikroinjektion. De porer som skapas genom tryckning har visat att stänga inom ca två timmar. Det finns emellertid en gräns för storleken hos porerna som skapas (~ 10 nm) med denna tryckningsteknik, som begränsar tekniken att injicera celler med små proteiner och / eller partiklar. 8,9,11
En standard HP DeskJet 500 skrivare ändrades för att möjliggöra för cell utskrift. 3, 5, 8 Omslaget till skrivaren bort och pappret matningsmekanismen var förbi med en mekanisk spak. Ett stadium skapades för att möjliggöra placering av objektglas och täckglas direkt under skrivhuvudet. Bläckpatroner öppnades, bläcket avlägsnades och de rengjordes före användning med celler. Tryckeriet Mönstret skapades med hjälp av standard ritprogram, som sedan styrde skrivaren via ett enkelt tryck kommando. 3T3 Fibroblaster odlades till konfluens, trypsiniserades och återsuspenderades sedan i fosfatbuffrad saltlösning med lösliga fluorescensmärkta g-aktin-monomerer. Cellsuspensionen pipetterades in i bläckpatronen och linjer av celler trycktes på täckglas mikroskop slirar. De levande cellerna avbildades med användning av fluorescensmikroskopi och aktin i hela cytoplasman. Inkorporering av en fluorescerande aktin i cellen tillåter avbildning av kortvariga cytoskelettala dynamik och är användbar för en mängd olika applikationer. 13-15
Processen att omvandla en vanlig skrivare bläckstråleskrivare skrivbordet för bioprinting är inte särskilt svårt. Den mest utmanande steget är att avgöra hur man ska kringgå mekanismen pappersmatning, som är beroende på märke och modell som används av skrivare. Emellertid är denna relativt enkla när pappersmatningskedjan sensorn är mekaniskt såsom beskrivits här. För modeller med optisk foder sensorer, kan andra tekniker behöva användas för att lura skrivaren att tro att det är att använda papper, till exempel, kan man köra en liten bit papper genom skrivaren medan den skriver på objektglas. Förbi mekanismen papperet foder sannolikt kommer att vara det svåraste steget i tillämpningen av dessa förfaranden för att olika skrivarmodeller.
Vid konstruktionen av en fas för att hålla täckglasen för tryckning, är det viktigt att säkerställa korrekt inriktning och höjd. Scenen bör göra det möjligt att täckglaset skall placeras i mitten av tryckområdet. Dessutom bör det PLace täckglaset på en lämplig höjd så att utrymme för tonerkassetten att passera över bilden utan att störa den. Den exakta höjden av scenen kommer att bero på skrivarmodell.
För att säkerställa att tryckta celler inte blir tvättas bort, de objektglasen placerades i en inkubator omedelbart efter tryckning under ca 30 minuter för att möjliggöra cellvidhäftning innan ytterligare celltillväxt-medium tillsattes. Eftersom cellerna är tryckta i en lösning som innefattar stora mängder av PBS cellerna inte torkar ut och förblev livskraftiga. Cellerna försågs med bild med användning av fluorescensmikroskopi för att visualisera fördelningen av de taggade G-aktin-monomerer inne i cellen (figurerna 1, 5-7). Vid utskrift med 3T3-fibroblaster, visar figur 5 ett representativt resultat med aktin orsakar mycket av cellen att fluorescera, men uppvisande linjer av ökad ljushet. Införlivandet av fluorescensmärkta g-aktin i cytoskelettet äranvändbara för studier av cytoskelett dynamik och cellulära mekanik. 12-15 En begränsning med denna teknik är att det är endast för molekyler och proteiner som har diametrar mindre än ca 10 nm.
Att säkerställa att cellerna faktiskt var som behandlas av den omvandlade skrivaren tillsattes DAPI (1:5000 i PBS) tillsattes till bioink i stället för hälften av volymen ren PBS. Den fluorescerande färgen DAPI binder till aminosyraklasser rika delar av DNA är belägna i kärnan. Därför DAPI är en användbar färgning i fluorescent avbildning kärnor av de tryckta celler. Figur 6 visar en representativ bild av en cell som visar både Alexa Fluor 488 (aktin) och DAPI (kärna) fluorescens med en överlagring bild av båda. Figur 7 illustrerar också hur cellerna kommer att fluorescera när de G-aktin-monomerer har införlivats medan icke-biologiskt material, som har deponerats i provet inte kommer att fluorescera på grund av den absence av g-aktin monomerer.
Ett viktigt övervägande för bioprinting är de vattenhaltiga medierna som används för bioink. Man fann att med användning av standardmetoder celltillväxtmedium med serum gav motsägande resultat. Detta är sannolikt på grund av igensättning av skrivhuvud munstycken från serumproteiner. Användning av PBS ökade konsistensen av tryckta mönster och antalet celler deponerade. En nackdel med användning av PBS är att celler inte skulle lämnas kvar i suspensionen under längre tidsperioder. Emellertid var fibroblaster i dessa exempel kan tolerera de bioink för åtminstone en timme utan någon ändring av cellviabilitet. Detta överensstämmer med flera tidigare fynd, som rapporterar att celler skrivas ut via termiska bläckstråleskrivare mekanismer har visat sig ha hög lönsamhet priser. 2-8
Denna modifierade Skrivarinställning kan användas för andra tillämpningar än cellen utskrift. 16-22 Matrix proteiner, såsom kollagen eller fibronectin, kan lätt tryckas på substrat med denna teknik, som kan vara användbara för cellen mönstring. Till exempel, kollagen typ I tryckt in linjemönster kommer att resultera i linje med varandra kollagen som kan användas för in vitro-cellodling studier. 17 Förutom matrisproteiner och andra molekyler, inklusive tillväxtfaktorer, kan tillförlitligt lokaliserad på substrat för cellstudier och potentiella terapeutiska tillämpningar. 18
En viktig begränsning av den konstruktion som beskrivs i ovanstående steg är att skrivaren är inte kapabel att skriva mer än en dimension. Detta begränsar möjligheterna för användning i mönstrade applikationer såsom schavotten utskrift. För att tillåta 3D tryckning, behöver en specialiserad steg som skall användas. Scenen måste ha inkrementella höjd justeringar för lager-på-lager avsättning av bioink.
Bioprinting har visat sig lovande som en effektiv och kostnadseffektiv metod för vävnadsteknik, Gen transfektion, micropatterning och microarray tillverkning 1-12, 16-22 De framtida tillämpningar av denna typ av enhet är många, inklusive: skapande av kontrollerade och mönstrade cellulära mikromiljöer, införlivande av makromolekyler till cellens cytoplasma och deposition av celler på byggnadsställningar och strukturer som inte förekommer naturligt eller effektivt.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka för Dr Thomas Boland för idén att använda HP Deskjet-skrivare för cell utskrift. Finansieringen för detta projekt från NSF RII-EPS 0903795 och NIH K25 HL0922280.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
HP DeskJet 500 | Hewlett-Packard | C2106A | Discontinued from manufacturer. Purchased refurbished DEC Trader. |
HP 26 Black Ink Cartridge | Hewlett-Packard | 51626A | |
Actin from rabbit muscle, Alexa Fluor 488 conjugate, 200 μg | Invitrogen | A12373 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Biomedicals | ICN1860454 | |
Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Scientific | SH3002201 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | Used at 0.5% in cell culture media |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Used at 0.5% in cell culture media |
Unidirectional Flow Clean Bench | Envirco | VLF 797 | Optional housing for keeping printer aseptic |