1.. Generering af kortsigtede menneskelige Antigen-specifikke CD8 T-cellelinjer 7 Separate perifere mononukleare blodceller (PBMC'er) fra blodet af normale raske HLA-A2 positive donorer ved hjælp af Ficoll-Paque Plus. Der tilsættes 2 ml / brønd af PBMC'er til plader med 6 brønde ved 2 x 10 6 celler / ml. Tilføj HLA-A2-bindende HER-2/neu p369-377 peptid (aminosyresekvens KIFGSLAFL) eller HLA-A2-bindende influenza P58-66-peptid (GILGFVFTL) direkte til brøndene i en endelig koncentration på 10 ug / ml og sted i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO2. Til at stimulere og udvide T-celler, tilføje, hver 2 dage, 250 gl / brønd frisk medium suppleret med human rekombinant IL-2 (lager: 50 units / pi) for at opnå en slutkoncentration på 50 enheder / ml i dyrkningsmediet. Re-stimulere dyrkningsceller med 2 x 10 6 celler / ml bestrålede autologe PBMC'er pulset i 2 timer med 10 ug / ml af de samme peptider brugerd i trin 1.3 og tilføje disse celler til kulturer ved 1 ml / brønd en uge efter den første peptidstimulering. Tilføj humane rekombinante IL-2 og friske medier, som beskrevet i trin 1.4, i de eksisterende kulturer hver 2 dage. Re-stimulere cellerne med peptid og bestrålede autologe PBMC'er som beskrevet i trin 1.5 en uge efter den anden peptidstimulering. Forbered dig på at bruge celler seks dage efter den sidste re-stimulation tidligst. 2.. Udarbejdelse af brystkræftceller Placer xCelligence impedans målestation (xCelligence station) i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO2. Harvest humane tumorceller (SKBR3, BT20, MCF7 eller HCC1419), der er 75% sammenflydende anvendelse af 0,25% trypsin og centrifugering (1.000 rpm i 5 minutter). Tælle tumorceller ved hjælp af et hæmocytometer og rekonstruere dem i RPMI tumor medier (suppleret med 10% kalvefosterserum (FBS) og 500 enheder / mlIFN-gamma) i en koncentration på 7,5 x 10 3 tumor celler/100 pi. Programmer xCelligence software ved at oprette layout siden for at bestemme godt layout og ved at oprette tidsplanen siden at tage impedans målinger hvert 5. minut for en 40 timers periode. For de første 18 timer, vil xCelligence system tager impedans aflæsninger af tumorcellerne alene. Tilføj 100 ul RPMI tumor medier til xCelligence E-plader og udføre en baggrund læsning ved at måle impedans i fravær af celler. Tilføj tumorceller til E-pladerne ved 100 pi per brønd og plads i xCelligence station. Tryk på startknappen på xCelligence software til at begynde at tage impedans læsninger af tumorcellerne, som straks begynder at overholde de E-plader. 3.. Co-kultur af tumor med CD8-T-celler Når tumorcellerne har lagt og fordoblet til 1,5 x 10 4 tumorceller per brønd (caende 18 timer efter oprindeligt at være belagt), tilberedt høst T-celler i afdeling 1 ved forsigtig skrabning og agitation Centrifuge ved 1.000 rpm i 5 minutter, og tælle T-celler ved hjælp af et hæmocytometer og rekonstruere dem i RPMI medier med 10% FBS i forskellige forhold, begyndende ved et maksimalt forhold på 1 tumorcelle til 40 T-celler og fortyndes 2 gange indtil et forhold på 1 tumorcelle til 1,25 T-celler er nået. For eksempel er der 1,5 x 10 4 tumorceller per brønd. For at opnå en 01:40-forhold, tilsættes 6 x 10 5 T-celler per brønd og fortyndes T-cellerne 2 gange indtil et forhold på 1,5 x 10 4 tumorceller til 1.875 x 10 4 T-celler per brønd (1:1,25 ratio) opnås. Pause i xCelligence station og fjern E-pladen. Fjern medierne i brøndene med en pipette og der tilsættes 200 ul af medier alene eller passende forhold mellem T-celler til brøndene. Placer E-pladen tilbage i xCelligence station og fortsætte xCelligence software program så impedans aflæsninger tages hver 5 minutter til cirka 20 timer efter T-celle tilsætning. Normalisere resultaterne i slutningen af analysen. 4.. Chromfrigivelsesanalyse (CRA) 7 Følg de institutionelle stråling sikkerhedsprocedurer, når de arbejder med 51 Cr og 51 Cr-mærkede målceller. Brug altid passende afskærmning for at reducere stråling. Pulse tumorceller i 2 timer ved 1 x 10 6 tumorceller / ml med 10 ul / ml frisk 51Cr (0,005 Ci / ml). Vask tumorceller i 10 ml RPMI medier med 10% FBS og centrifugeres ved 1.000 rpm i 5 minutter. Tilføj tumorceller til en 96-brønds rundbundet plade på 1 x 10 5 tumorceller i 100 gl / brønd. Tilføj T-celler i forskellige forhold, begyndende fra 1 tumorcelle til 40 T-celler og fortyndes 2 gange indtil et forhold på 1 tumorcelle til 1,25 T-celler er opnået. For eksempel er der 1 x 10 5 tumorceller brønd. For at opnå en 01:40-forhold, tilsættes 4 x 10 6 T-celler per brønd og fortyndes T-cellerne 2 gange indtil et forhold på 1 x 10 5 tumorceller til 1,25 x 10 5 T-celler per brønd (1:1,25 ratio) opnås. Tilføj spontane og maksimal tumorcellelinier kontrolelementer til pladen. For at beregne den spontane frigivelse af 51Cr fra tumorcellerne, tilføje seks brønde hver indeholder 1 x 10 5 tumorceller i 100 pi til 100 ul RPMI medier med 10% FBS. At beregne det maksimale frigivelse af 51Cr fra tumorcellerne, tilføje seks brønde hver indeholder 1 x 10 5 tumorceller i 100 pi til 100 gl 0,1% Triton X-100 i PBS, der lyserer alle celler. Pladerne inkuberes i 5 timer ved 37 ° C med 5% CO2. Efter inkubation fjernes 50 pi af supernatanten fra hver brønd og føje det til en Luma plade. Tør pladerne natten over og måle CPM ved hjælp af en gammatæller. le "> 5.. procent lyse Beregning Impedans assay: Tag impedans læsning, rapporteret som cellen indeks (CI), på forskellige tidspunkter, og bruge følgende formel til at bestemme procent lyse: (CI tumor kun – (CI tumor + T-celler)) / (CI tumor only) * 100. CRA: Brug følgende formel til at bestemme procent lyse: (CPM eksperimentel – CPM spontan) / (CPM maksimum – CPM spontan) * 100. 6.. Repræsentative resultater T-celler alene ikke øger impedans T-celler, i almindelighed, ikke overholder de fleste faste overflader og kræver ikke tilslutning til aktivering og proliferation. Derfor blev det antaget, at T-celler ikke bør bidrage til impedans på xCelligence E-plader. For at teste dette, blev brønde fyldt med enten SKBR3 brystcancerceller eller frisk oprensede humane CD8 T-celler. Impedans blev målt i løbet af 40 timer, og et repræsentativt eksempel demonstbedømmelse væsentlige ringe effekt af T-celler er vist i figur 1A. Derimod kan det hævdes, at T-celler kan mindske baggrund impedans, omend kun lidt. Alligevel viser co-kultur, at processen med at tilføje T-celler ved 18 timer efter påbegyndelse af impedansmålinger resulterede i en impedans afbrydelse (figur 1B). Andre undersøgelser viste, at afbrydelser skyldtes delvis håndtering da formindskelsen i signalet kan reduceres ved at sikre, at temperaturen af den T-celle-holdige opløsning blev den samme som i det indre af inkubatoren. Reduktioner i impedans medieret af T-celler er dosisafhængig. Anvendeligheden af en impedans-baseret assay at sammenligne prøver til cytotoksisk T-celle aktivitet kræver evnen til at skelne mellem forskellige koncentrationer af antigen-specifikke T-celler. At teste, om dette er muligt, SKBR3 celler blev co-dyrket med varierende koncentrationertioner af T-celler afledt fra en HER-2/neu p369-specifik T-cellelinie. Som vist i figur 2A, reduktioner i impedans var dosisafhængig af T-celler. 2b viser at cellernes indeks på 10 timer følge en simpel anden ordens polynomium over området af T-celler. Således xCelligence station overvåger CD8 T-celle medieret død SKBR3 tumorer i realtid som en dråbe i celle indeks. Den impedans-baserede assay detekterer antigen-specifikke T-celler At afgøre, om reduktioner i impedans af SKBR3, hvilket er et HER-2/neu og HLA-A2 positiv brystkræft tumor cellelinie ved HER-2/neu p369-specifikke T-celler var antigenspecifikke, separate brønde indeholdende SKBR3 blev også inkuberet med T-celler afledt fra en influenza (FLU)-specifik T-cellelinie. Flu specifik T-celler tjente som en ikke-specifik kontrol, er HLA-A2 positiv, men ikke har nogen evne til at genkende HER-2/neu. Som vist i Figur 3, der er en betydelig forskel mellem den lytiske aktivitet af HER-2/neu p369-specifikke T-celler sammenlignet med FLU-specifikke T-celler (p <0,0001). I nogle tilfælde (f.eks FLU-specifik eller anti-CD3/anti-CD28 stimulerede) T-celler ikke er specifikke for tumor påvist et lavt niveau af lytisk aktivitet (figur 3A-B). T-celler kan dræbe på en af to måder, enten ikke-specifikt gennem Fas: Fas ligand interaktioner eller antigen-specifikt ved frigivelse af granzymes og perforins. For yderligere underbygge den opfattelse, at HER-2/neu-specific T-celler blev dræbt i et antigen-specifik måde, vi indarbejdet et blokerende antistof mod Fas-ligand. Som vist i figur 3B har antistoffet ikke reducere den lytiske aktivitet af HER-2/neu p369-specifikke T-celler. Antistoffet kunne hæmme interaktioner mellem Fas-og Fas-ligand, som demonstreret med T-celler, der var ikke-specifikt aktiveret med anti-CD3/CD28 perler. Disse resultater antyder, at nårtumor-specifikke T-celler testes med ikke-tumor-specifikke T-celler, kan Fas-ligand blokade være nødvendig for at reducere ikke-TCR-medierede interaktioner til et minimum. Alternativt, når der anvendes korte dyrkede T-cellelinjer, hvor kun en brøkdel af T-cellerne er specifikke for antigenet, der anvendes til ex vivo generation, kan muligheden for MHC mismatch-medieret T-celleaktivering forekomme fører til ikke-specifik lysis. I dette tilfælde kan tilsætning af antistoffer, der blokerer de irrelevante HLAs være berettiget. At afgøre, om p369-specifikke T-celler dræbte tumorceller i et HLA klasse I afhængige måde, enten anti-HLA-klasse I-antistof eller isotypekontrolantistof blev tilsat til co-kulturer. Som vist i figur 3C, lysering af p369-specifikke T-celler blev undertrykt ved inklusion af antistof viser HLA klasse I restriktion. Endelig, da udviklingen af denne assay i vid udstrækning blev gjort ved hjælp SKBR3, var det vigtigt at konstatere, om andre klæbende HLA-A2 og HER-2/neu udtrykkende tumorceller kan blive dræbt af p369-specifikke T-celler. Således blev T-celler fremstillet og tilsat ved en 1:5 til HLA-A2 og HER-2/neu-expressing tumorceller, SKBR3, MCF-7, og HCC1419 celler. HLA-A2-negativ tumor cellelinie, blev BT20 anvendt som en negativ kontrol. Som vist i figur 3D, alle disse ekstra tumorceller, undtagen BT20 blev også dræbt som vurderet ved impedans. Den metode synes at være anvendelige til flere mål adhærente tumorceller. Den impedans-baserede assay er mere følsom end standard-chromfrigivelsesanalyse i påvisning cytotoksisk T-celle-aktivitet Krom (51Cr) frigivelse assay (CRA), som måler cytolytisk aktivitet har længe været den gyldne standard ved at overvåge CD8 T-celle responser. I dette assay er målceller (f.eks tumorceller) mærket med 51 Cr. I de fleste tilfælde kan raske målceller bevarer størstedelen afradiomærke løbet af assayet. CD8 T celler tilsættes til målcellerne, sædvanligvis ved varierende koncentrationer, og aflivning af målcellerne påvises ved frigivelse af 51Cr til mediet. Bortset fra det faktum, at det bruger farlig stråling, to store problemer med CRA er en mangel på følsomhed og at assayet kræver typisk store mængder CD8 T-celler, hvilket begrænser dens anvendelighed. At afgøre, om impedans-baserede assay var mere følsom end CRA, HER-2/neu p369-specifikke T-celler blev genereret in vitro og anvendt i varierende mængder, at e-plader indeholdende umærkede tumorceller eller standard polypropylen plader, der indeholder 51Cr-mærkede målceller. Målinger, enten impedans eller gratis chrom, blev målt ved 5 timer efter T-celle tilføjelse. Figur 4 et repræsentativt eksempel viser impedans analysen udkonkurrerer chrom udgivelse. Den intra-assay variationaf impedans-baserede assay er typisk under 20%. Intra-assay variation blev undersøgt, da udbredt anvendelse af denne analyse vil i vid udstrækning blive bestemt af dens reproducerbar og variation (figur 5). To p369-specifikke T-cellelinjer blev frembragt uafhængigt 30 dage fra hinanden og tilsættes in triplo over et område af tumor celle til T-celle-forhold. Det indsatte graf i figur 5 viser, at linjerne var stort set tilsvarende i form af lysering SKBR3 celler. Den% variationskoefficient blev beregnet ved hver celle ratio og plottet. Som vist i figur 5 1:40 til 01:05 nøgletal for% variationskoefficienter (CV), var under 15%. På 1:2,5 og 1:1,25, dog CV'er var høj eller uforudsigelige. På grund af omfattende biologiske variation, er det ikke muligt at måle inter-assay variation med primære T-cellelinier. <br /> Figur 1. Impedans skal normaliseres efter tilsætning af T-cellerne. Panel A: viser, at tumorceller (rød linje) og ikke T-celler (blå linie) er ansvarlige for impedans. Vist er impedans optagelserne over 40 timer for enten tumor-eller T-celler alene. Lignende resultater blev opnået fra et andet eksperiment. Bemærk, at signalet forstyrrelse på cirka 20 timer repræsenterer punktet for tilsætning af T-celler til brøndene ikke indeholder tumorceller Panel B:. Viser, at impedansmålinger forbigående er afbrudt med tilsætning af T-celler til tumorceller. Dette kræver normalisering på et tidspunkt efter tilsætning af T-celler (se punkt normalisering markeret i grafen). Traces er sammensat fra dublerede datapunkter. Sporet for tumorceller alene er vist i rødt. De andre spor repræsenterer tumorceller co-dyrket med HER-2/neu p369-specifikke T-celler (blå: forholdet 1,25 T-celler / tumorcelle, Green:forholdet 40 T-celler / tumor celle). Hvert spor er beregnet ud fra dobbeltbestemmelser datapunkter indsamlet hver 5 minutter gennem varigheden af kulturen. Resultaterne er repræsentative for 3 separate eksperimenter. Klik her for at se større figur . Figur 2. Reduktion i impedans medieret af T-celler er dosisafhængig. Panel A: Vist er impedans spor af SKBR3 tumorceller inkuberet alene eller med varierende koncentrationer af tumor-specifikke T-celler. Hvert spor er beregnet ud fra tredobbelte datapunkter indsamlet hver 5 minutter gennem varigheden af kulturen. Resultaterne er repræsentative for 3 separate eksperimenter Panel B:. Vist er den celle indeks ved 10 timer på tværs alle T-celle / tumor cellekoncentrationer. Den stiplede linie repræsenterer cellen indekset for tumorceller alén. Hvert symbol er middelværdien (± SEM) af tredobbelte bestemmelser. Resultaterne er repræsentative for 3 separate eksperimenter. Klik her for at se større figur . Figur 3. Impedans baseret analyse påviser antigen-specifikke cytotoksiske T-celle-responser. Panel A viser niveauet af lyse af SKBR3 celler ved HER-2/neu p369-specifikke T-celler (rød) eller influenza-specifikke T-celler (blå) ved 5, 10 og 15 timer efter co-dyrkning. Hvert datapunkt er middelværdien (± SEM) af tredobbelte målinger. Resultaterne er repræsentative for 3 separate forsøg. Panel B viser lysis af SKBR3 af p369-specifikke T-celler eller ikke-specifikt aktiverede T-celler, hvilket viser, at antigen-specifik lysis skyldes ikke Fas-Fas ligand-interaktioner. Sorte bjælker repræsenterer co-kulturer,indeholdt en Fas-ligand antistof. Hver søjle er middelværdien (± SEM) lysering i tredobbeltbestemmelse ved 5 timer efter tilsætningen af T-celler. Resultaterne er repræsentative for 3 separate forsøg. Panel C viser lysis 10 timer efter T-celle tilsætning af SKBR3 af p369-specifikke T-celler er HLA-klasse I afhængige. Enten HLA-klasse I blokering eller isotypekontrol blev tilføjet i løbet af co-kultur. Hver søjle er middelværdien (± SEM) lysering i tre eksemplarer. Dette eksperiment blev gentaget to gange med lignende resultater. Panel D viser% lysis 10 timer efter T-celle tilsætning af flere HLA-A2 +, HER-2/neu-expressing tumorcellelinier ved p369-specifikke T-celler. BT20, blev en HLA-A2-negativ brystkræft cellelinie anvendt som en negativ kontrol. Hver plet repræsenterer et enestående eksperiment beregnet ud fra tredobbelte bestemmelser. Klik her for at se større figur . <img src = "/ files/ftp_upload/3683/3683fig4.jpg" alt = "Figur 4" /> Figur 4.. Impedans baseret assay er mere følsom end chromfrigivelsesanalyse til påvisning af tumor antigen-specifikke T-celler. Vist er% lysis af SKBR3 som reaktion på forskellige koncentrationer af p369-specifikke T-celler som målt ved 5 timer efter tumor og T-celle blanding ved hjælp af både impedans-baserede assay og chromfrigivelsesanalyse. Hvert symbol er middelværdien (± SEM) af tre gentagelser. Resultaterne er repræsentative for 3 separate forsøg. Figur 5. % Intra-assay variationskoefficienter af impedans-baserede T-celle cytotoksicitet assay. Vist er middelværdier (± SD)% intra-assay variationskoefficienter i lysis af SKBR3 over en række koncentrationer af antigen-specifikke T-celler. Hvert symbol er middelværdien af tre gentagelser. Numre, der vises i grafen er than mener% CV. Indsat panel viser den middel (± SEM, n = 3)% lysis af SKBR3 ved varierende koncentrationer af p369-377-specifikke T-celler. To uafhængigt genereret p369-specifikke T-cellelinier med T-celler fra to separate donorer er vist.