JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Protocol
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

Detektion av toxin Translokation i den mottagande cytosolen genom Surface Plasmon Resonance

Published: January 03, 2012
doi:
10.3791/3686
, , ,
1Department of Molecular Biology and Microbiology,University of Central Florida

Summary

I denna rapport beskriver vi hur ytplasmonresonans används för att upptäcka toxin inträde i den mottagande cytosolen. Denna mycket känsliga metoden kan ge kvantitativa uppgifter om mängden cytosolic toxin, och den kan tillämpas på en rad olika gifter.

Abstract

AB gifter består av en enzymatisk En subenhet och en cell-bindande B-subenhet 1. Dessa gifter utsöndras i den extracellulära miljön, men de agerar på mål inom eukaryota cytosolen. Vissa AB gifter resa med vesikler transportörer från cellytan till endoplasmatiska retiklet (ER) innan cytosolen 2-4. I ER, för att den katalytiska En kedja dissocierar från resten av toxinet och rör sig genom en protein-ledande kanalen nå sitt cytosoliskt mål 5. Den flyttas, cytosoliskt En kedja är svåra att upptäcka eftersom toxin människohandel till ER är en mycket ineffektiv process: de flesta internaliseras toxin är dirigeras till lysosomer för nedbrytning, så bara en liten del av ytbundet toxin når Golgiapparaten och ER 6 -12.

För att övervaka toxin translokation från ER till cytosolen i odlade celler, kombinerade vi en subcellulära fraktionering protokoll med highly känslig metod för ytplasmonresonans (SPR) 13-15. Membranet på toxin-behandlade celler är selektivt permeabilized med digitonin, vilket gör att insamling av en cytosoliskt bråkdel som sedan perfusion över en SPR-sensor belagda med ett anti-toxin En kedja antikropp. De antikroppsförsedda sensorn kan fånga och upptäcka pg / ml mängder cytosoliska toxin. Med detta protokoll är det möjligt att följa kinetiken av toxin inträde i cytosolen och för att karakterisera hämmande inverkan på translokation evenemanget. Koncentrationen av cytosolic toxin kan också beräknas från en standardkurva som genereras med kända mängder av en kedja standarder som har perfusion över sensorn. Vår metod är en snabb, känslig och kvantitativ detektionssystem som inte kräver radioaktiv inmärkning eller andra ändringar till målet toxin.

Protocol

1. Beredning av digitonin Tillsätt 500 mikroliter på 100% etanol till ett mikrocentrifugrör och placera den i ett värmeblock inställd på 80 ° C i 10 min. Lös 2,5 mg digitonin i 250 mikroliter av den uppvärmda etanol för att producera en 1% stamlösning av digitonin. För att generera en fungerande lösning av 0,04% digitonin, tillsätt 40 mikroliter av digitonin stamlösning till 960 mikroliter av HCN buffert (50 mM Hepes pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 10 mm N-Ethyl…

Discussion

Jämförelse med den befintliga metoden

Vår SPR-baserade translokation analysen representerar en snabb, känslig och kvantitativ metod för att upptäcka toxin leverans i den mottagande cytosolen. Tekniken kräver inte radioaktiv inmärkning eller andra ändringar av toxin, och det kan tillämpas på alla toxin som en anti-toxin A-kedjan antikropp är tillgänglig. Befintliga metoder för att övervaka toxin passage i cytosolen bygger också på en subcellulära fraktionering protokoll till u…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete har finansierats av NIH bidrag R01 AI073783 till K. Teter. Vi tackar Dr Shane Massey för att få hjälp i utvecklingen av subcellulära fraktionering protokoll och Helen Burress för kritisk läsning av manuskriptet.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
Digitonin Sigma D141
Ethanol Acros 61509-0010
DMEM Invitrogen 11995065
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550
Ganglioside GM1 Sigma G7641
CTA Sigma C2398
PTS1 List 182
NHS (N-Hydroxysuccinimide) Pierce 24500
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) Thermo Scientific 22981
Ethanolamine Sigma E0135
PBST Medicago 09-8903-100
Anti-CTA antibody Santa Cruz Biotech sc-80747
Anti-CTB antibody Calbiochem 227040
Anti-PTS1 antibody Santa Cruz Biotech sc-57639
Refractometer Reichert SR7000, SR7000DC
SPR sensor slides Reichert 13206060
Syringe pump Cole Palmer 780200C
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Sandvig, K., van Deurs, B. Membrane traffic exploited by protein toxins. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 1-24 (2002).
  2. Watson, P., Spooner, R. A. Toxin entry and trafficking in mammalian cells. Adv. Drug Deliv. Rev. 58, 1581-1596 (2006).
  3. Carbonetti, N. H. Pertussis toxin and adenylate cyclase toxin: key virulence factors of Bordetella pertussis and cell biology tools. Future Microbiol. 5, 455-469 (2010).
  4. Wernick, N. L. B., Chinnapen, D. J. -. F., Cho, J. A., Lencer, W. I. Cholera toxin: an intracellular journey into the cytosol by way of the endoplasmic reticulum. Toxins. 2, 310-325 (2010).
  5. Lord, J. M., Roberts, L. M., Lencer, W. I. Entry of protein toxins into mammalian cells by crossing the endoplasmic reticulum membrane: co-opting basic mechanisms of endoplasmic reticulum-associated degradation. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 300, 149-168 (2005).
  6. Lencer, W. I. Entry of cholera toxin into polarized human intestinal epithelial cells. Identification of an early brefeldin A sensitive event required for A1-peptide generation. J. Clin. Invest. 92, 2941-2951 (1993).
  7. Orlandi, P. A., Curran, P. K., Fishman, P. H. Brefeldin A blocks the response of cultured cells to cholera toxin. Implications for intracellular trafficking in toxin action. J. Biol. Chem. 268, 12010-12016 (1993).
  8. Sandvig, K., Prydz, K., Hansen, S. H., van Deurs, B. Ricin transport in brefeldin A-treated cells: correlation between Golgi structure and toxic effect. J. Cell. Biol. 115, 971-981 (1991).
  9. Sandvig, K., Prydz, K., Ryd, M., van Deurs, B. Endocytosis and intracellular transport of the glycolipid-binding ligand Shiga toxin in polarized MDCK cells. J. Cell Biol. 113, 553-562 (1991).
  10. van Deurs, B. Estimation of the amount of internalized ricin that reaches the trans-Golgi network. J. Cell Biol. 106, 253-267 (1988).
  11. Tam, P. J., Lingwood, C. A. Membrane cytosolic translocation of verotoxin A1 subunit in target cells. Microbiology. 153, 2700-2710 (2007).
  12. Plaut, R. D., Carbonetti, N. H. Retrograde transport of pertussis toxin in the mammalian cell. Cell. Microbiol. 10, 1130-1139 (2008).
  13. Willander, M., Al-Hilli, S. Analysis of biomolecules using surface plasmons. Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).
  14. Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 377, 528-539 (2003).
  15. Medaglia, M. V., Fisher, R. J., Golemis, E. . Protein-Protein Interactions. , 255-272 (2002).
  16. Banerjee, T. Contribution of subdomain structure to the thermal stability of the cholera toxin A1 subunit. Bioquímica. 49, 8839-8846 (2010).
  17. Massey, S. Stabilization of the tertiary structure of the cholera toxin A1 subunit inhibits toxin dislocation and cellular intoxication. J. Mol. Biol. 393, 1083-1096 (2009).
  18. Taylor, M. A therapeutic chemical chaperone inhibits cholera intoxication and unfolding/translocation of the cholera toxin A1 subunit. PLoS ONE. 6, e18825-e18825 (2011).
  19. Taylor, M. Hsp90 is required for transfer of the cholera toxin A1 subunit from the endoplasmic reticulum to the cytosol. J. Biol. Chem. 285, 31261-31267 (2010).
  20. Donta, S. T., Beristain, S., Tomicic, T. K. Inhibition of heat-labile cholera and Escherichia coli enterotoxins by brefeldin A. Infect. Immun. 61, 3282-3286 (1993).
  21. Donta, S. T., Tomicic, T. K., Donohue-Rolfe, A. Inhibition of Shiga-like toxins by brefeldin. A. J. Infect. Dis. 171, 721-724 (1995).
  22. Nambiar, M. P., Oda, T., Chen, C., Kuwazuru, Y., Wu, H. C. Involvement of the Golgi region in the intracellular trafficking of cholera toxin. J. Cell. Physiol. 154, 222-228 (1993).
  23. Rapak, A., Falnes, P. O., Olsnes, S. Retrograde transport of mutant ricin to the endoplasmic reticulum with subsequent translocation to cytosol. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 3783-3788 (1997).
  24. Xu, Y., Barbieri, J. T. Pertussis toxin-mediated ADP-ribosylation of target proteins in Chinese hamster ovary cells involves a vesicle trafficking mechanism. Infect. Immun. 63, 825-832 (1995).
  25. Yoshida, T., Chen, C. C., Zhang, M. S., Wu, H. C. Disruption of the Golgi apparatus by brefeldin A inhibits the cytotoxicity of ricin, modeccin, and Pseudomonas toxin. Exp. Cell Res. 192, 389-395 (1991).
  26. Godber, B. Direct quantification of analyte concentration by resonant acoustic profiling. Clin. Chem. 51, 1962-1972 (2005).
  27. Bernardi, K. M., Forster, M. L., Lencer, W. I., Tsai, B. Derlin-1 facilitates the retro-translocation of cholera toxin. Mol. Biol. Cell. 19, 877-884 (2008).
  28. Wernick, N. L., De Luca, H., Kam, W. R., Lencer, W. I. N-terminal Extension of the Cholera Toxin A1-chain Causes Rapid Degradation after Retrotranslocation from Endoplasmic Reticulum to Cytosol. J. Biol. Chem. 285, 6145-6152 (2010).
  29. Simpson, J. C. Ricin A chain utilises the endoplasmic reticulum-associated protein degradation pathway to enter the cytosol of yeast. FEBS. Lett. 459, 80-84 (1999).
  30. Veithen, A., Raze, D., Locht, C. Intracellular trafficking and membrane translocation of pertussis toxin into host cells. Int. J. Med. Microbiol. 290, 409-413 (2000).
  31. Castro, M. G., McNamara, U., Carbonetti, N. H. Expression, activity and cytotoxicity of pertussis toxin S1 subunit in transfected mammalian cells. Cell. Microbiol. 3, 45-54 (2001).
  32. Schmitz, A., Herrgen, H., Winkeler, A., Herzog, V. Cholera toxin is exported from microsomes by the Sec61p complex. J. Cell Biol. 148, 1203-1212 (2000).
  33. Teter, K., Allyn, R. L., Jobling, M. G., Holmes, R. K. Transfer of the cholera toxin A1 polypeptide from the endoplasmic reticulum to the cytosol is a rapid process facilitated by the endoplasmic reticulum-associated degradation pathway. Infect. Immun. 70, 6166-6171 (2002).
  34. Winkeler, A., Godderz, D., Herzog, V., Schmitz, A. BiP-dependent export of cholera toxin from endoplasmic reticulum-derived microsomes. FEBS Lett. 554, 439-442 (2003).
  35. Yu, M., Haslam, D. B. Shiga toxin is transported from the endoplasmic reticulum following interaction with the luminal chaperone HEDJ/ERdj3. Infect. Immun. 73, 2524-2532 (2005).
  36. LaPointe, P., Wei, X., Gariepy, J. A role for the protease-sensitive loop region of Shiga-like toxin 1 in the retrotranslocation of its A1 domain from the endoplasmic reticulum lumen. J. Biol. Chem. 280, 23310-23318 (2005).
  37. Teter, K., Jobling, M. G., Sentz, D., Holmes, R. K. The cholera toxin A13 subdomain is essential for interaction with ADP-ribosylation factor 6 and full toxic activity but is not required for translocation from the endoplasmic reticulum to the cytosol. Infect. Immun. 74, 2259-2267 (2006).
  38. Redmann, V. Dislocation of ricin toxin a chains in human cells utilizes selective cellular factors. J. Biol. Chem. 286, 21231-21238 (2011).
  39. Yamaizumi, M., Mekada, E., Uchida, T., Okada, Y. One molecule of diphtheria toxin fragment A introduced into a cell can kill the cell. Cell. 15, 245-250 (1978).
  40. Bellisola, G. Reductive activation of ricin and ricin A-chain immunotoxins by protein disulfide isomerase and thioredoxin reductase. Biochem. Pharmacol. 67, 1721-1731 (2004).
  41. McKee, M. L., FitzGerald, D. J. Reduction of furin-nicked Pseudomonas exotoxin A: an unfolding story. Bioquímica. 38, 16507-16513 (1999).
  42. Orlandi, P. A. Protein-disulfide isomerase-mediated reduction of the A subunit of cholera toxin in a human intestinal cell line. J. Biol. Chem. 272, 4591-4599 (1997).
  43. Spooner, R. A. Protein disulphide-isomerase reduces ricin to its A and B chains in the endoplasmic reticulum. Biochem. J. 383, 285-293 (2004).
  44. Fujinaga, Y. Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm. Mol. Biol. Cell. 14, 4783-4793 (2003).
  45. Guerra, L. Cellular internalization of cytolethal distending toxin: a new end to a known pathway. Cell. Microbiol. 7, 921-934 (2005).
  46. Johannes, L., Tenza, D., Antony, C., Goud, B. Retrograde transport of KDEL-bearing B-fragment of Shiga toxin. J. Biol. Chem. 272, 19554-19561 (1997).
  47. Deeks, E. D. The low lysine content of ricin A chain reduces the risk of proteolytic degradation after translocation from the endoplasmic reticulum to the cytosol. Bioquímica. 41, 3405-3413 (2002).
  48. Hazes, B., Read, R. J. Accumulating evidence suggests that several AB-toxins subvert the endoplasmic reticulum-associated protein degradation pathway to enter target cells. Bioquímica. 36, 11051-11054 (1997).
  49. Rodighiero, C., Tsai, B., Rapoport, T. A., Lencer, W. I. Role of ubiquitination in retro-translocation of cholera toxin and escape of cytosolic degradation. EMBO Rep. 3, 1222-1227 (2002).
  50. Worthington, Z. E., Carbonetti, N. H. Evading the proteasome: absence of lysine residues contributes to pertussis toxin activity by evasion of proteasome degradation. Infect. Immun. 75, 2946-2953 (2007).
  51. Pande, A. H., Moe, D., Jamnadas, M., Tatulian, S. A., Teter, K. The pertussis toxin S1 subunit is a thermally unstable protein susceptible to degradation by the 20S proteasome. Bioquímica. 45, 13734-13740 (2006).
  52. Pande, A. H. Conformational instability of the cholera toxin A1 polypeptide. J. Mol. Biol. 374, 1114-1128 (2007).

Tags

Toxin TranslocationSurface Plasmon ResonanceAB ToxinsCell-binding B SubunitVesicle CarriersEndoplasmic Reticulum (ER)Catalytic A ChainProtein-conducting ChannelCytosolic TargetToxin TraffickingLysosomesGolgi ApparatusSubcellular Fractionation ProtocolDigitonin PermeabilizationAnti-toxin A Chain AntibodyDetection Method
check_url/pt/3686?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Taylor, M., Banerjee, T., VanBennekom, N., Teter, K. Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance. J. Vis. Exp. (59), e3686, doi:10.3791/3686 (2012).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image