Detecção de translocação Toxina no Citosol host por ressonância plasmon de superfície

Resumo

Neste relatório, nós descrevemos como ressonância de plasma de superfície é usado para detectar a entrada de toxinas para o citosol host. Este método altamente sensível pode fornecer dados quantitativos sobre a quantidade de toxina citosólica, e pode ser aplicado a uma variedade de toxinas.

Resumo

Toxinas AB consistem de uma subunidade enzimática A e uma célula de ligação da subunidade B ^1. Estas toxinas são secretadas para o meio extracelular, mas agir de acordo com as metas dentro do citosol eucarióticas. Algumas viagens AB toxinas pelas transportadoras vesícula da superfície da célula para o retículo endoplasmático (ER) antes de entrar no citosol ^2-4. Na ER, o dissocia catalítico Uma cadeia do resto da toxina e se move através de um canal condutor de proteína para atingir o seu objectivo citosólica ^5. O translocados, a cadeia A citosólica é difícil de detectar porque o tráfico de toxinas para o ER é um processo extremamente ineficiente: a toxina mais internalizado é encaminhado para a lisossomos para degradação, portanto, apenas uma pequena fração da superfície-bound toxina atinge o aparelho de Golgi e ER ^{6 -12.}

Para monitorar a translocação da toxina da ER para o citosol em cultura de células, nós combinamos um protocolo de fracionamento subcelular com o highly método de detecção sensível de ressonância plasmon de superfície (SPR) ^13-15. A membrana plasmática das células tratadas com a toxina é seletivamente permeabilizadas com digitonina, permitindo cobrança de uma fração citosólica que posteriormente é perfundido durante um sensor de SPR revestido com uma toxina anti-Um anticorpo cadeia. O sensor de anticorpos revestido pode capturar e detectar pg / mL quantidades de toxina citosólica. Com este protocolo, é possível acompanhar a cinética de entrada de toxinas para o citosol e caracterizar efeitos inibitórios sobre o evento de translocação. A concentração de toxina citosólica também pode ser calculado a partir de uma curva padrão gerada com quantidades conhecidas de A cadeia de padrões que foram perfundidos sobre o sensor. Nosso método representa uma resposta rápida, sensível sistema de detecção e quantitativas que não requer marcação radioactiva ou outras modificações à toxina alvo.

Protocolo

1. Preparação de digitonina

1. Adicionar 500 mL de etanol a 100% para um tubo de microcentrífuga e colocá-lo em um bloco de aquecimento fixado em 80 ° C por 10 min.
2. Dissolver 2,5 mg de digitonina em 250 mL de etanol aquecido para produzir uma solução estoque de 1% do digitonina.
3. Para gerar uma solução de trabalho de digitonina 0,04%, adicionar 40 mL da solução estoque para 960 mL digitonina de HCN tampão (50 mM Hepes pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl _2, 10 mM N-etilmaleimida, e um inibidor de protease cocktail).

2. Intoxicação celular e permeabilização

Nosso ensaio trans....

Discussão

Comparação com a metodologia existente

Nosso ensaio translocação SPR baseado representa um método rápido, sensível, e quantitativa para detectar entrega toxina no citosol host. A técnica não requer marcação radioactiva ou outras modificações à toxina, e pode ser aplicado a qualquer toxina para o qual um anti-toxina Um anticorpo cadeia está disponível. Métodos existentes para monitorar a passagem de toxinas para o citosol também dependem de um protocolo de fracionamento subcelular de extratos p.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
Digitonina	Sigma	D141
Etanol	Acros	61509-0010
DMEM	Invitrogen	11995065
Soro fetal bovino	Atlanta Biologicals	S11550
Gangliosídeo GM1	Sigma	G7641
CTA	Sigma	C2398
PTS1	Lista	182
NHS (N-Hydroxysuccinimide)	Perfurar	24500
EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida)	Thermo Scientific	22981
Etanolamina	Sigma	E0135
PBST	Medicago	09-8903-100
Anti-CTA de anticorpos	Santa Cruz Biotech	sc-80747
Anticorpo anti-CTB	Calbiochem	227040
Anticorpos anti-PTS1	Santa Cruz Biotech	sc-57639
Refratômetro	Reichert	SR7000, SR7000DC
SPR sensor de slides	Reichert	13206060
Bomba de seringa	Cole Palmer	780200C