Den neuroblast Assay: Et assay for generering og berigelse af neuronale progenitorceller fra Differentiering neural stamcelle Afkom anvendelse af flowcytometri
Summary
Denne video protokol viser en hidtil ukendt fremgangsmåde til generering og efterfølgende oprensning af neuronale progenitorceller fra en fornyelig kilde af neurale stamceller (NSC) baseret på deres fysiske (størrelse og intern granularitet) og fluorescerende egenskaber ved hjælp af flowcytometri-teknologi.
Abstract
Neurale stamceller (NSC) kan isoleres og ekspanderes i stor skala ved hjælp af neurosfæren assayet og differentieret i de tre primære celletyper i centralnervesystemet (CNS), nemlig astrocytter, oligodendrocytter og neuroner. Disse egenskaber gør neurale stam-og progenitorceller en uvurderlig vedvarende kilde af celler til in vitro-undersøgelser, såsom lægemiddel-screening, neurotoxicology og elektrofysiologi og også for celle substitutionsterapi mange neurologiske sygdomme. I praksis er imidlertid heterogenitet NSC afkom, lav produktion af neuroner og oligodendrocytter, og overvægt af astrocytter efter differentiering begrænse deres kliniske anvendelser. Her beskriver vi en hidtil ukendt metode til generering og efterfølgende oprensning af umodne neuroner fra murine NSC afkom med fluorescensaktiveret cellesortering (FACS)-teknologi. Anvendelse af denne metode kan en stærkt beriget neuronal progenitorcellepopulation opnås vidHout nogen mærkbar astrocyt og bona fide NSC forurening. Fremgangsmåden omfatter differentiering af NSC afkom isoleres og ekspanderes fra E14 muse ganglioniske Eminencer anvendelse af neurosfæren assayet, efterfulgt af isolering og berigelse af umodne neuronale celler baseret på deres fysiske (størrelse og intern kompleksitet) og fluorescerende egenskaber ved hjælp af flowcytometri-teknologi. Alt i alt tager det 5-7 dage at generere neurosfærerne og 6-8 dage til at differentiere NSC afkom og isolere højtoprensede umodne nerveceller.
Protocol
Discussion
Evnen til at isolere defineret neurale cellepopulationer (dvs. neuroner, astrocytter og oligodendrocytter) kan løse nogle af de hindringer, der er forbundet med den kliniske anvendelse af neurale stamceller (NSC). For det første sætter os i stand til fuldt ud at karakterisere start befolkning donorceller. For det andet tillader os at anvende en bestemt celletype eller en kombination af forskellige celletyper med et specifikt forhold, afhængig af beskaffenheden eller stadiet af sygdommen. Endelig kan ved hjælp af h?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet med midler fra Overstreet Foundation.
Materials
| Name of the reagent | Tipo | Company | Catalogue number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
| Anti-PSA-NCAM-PE | Antibody | Miltenyi Biotec | 130-093-274 | |
| PE- Conjugated mouse IgG1 | Isotype control antibody | BD Pharminogen | 556029 | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
| HrBMP-4 | Growth factor | R&D | 314-BP-010 | |
| Poly-L-Ornithine | Reagent | Sigma | P4957 | |
| Fetal Calf Serum | Medium Supplement | Gibco | 10099-141 | |
| GFAP | Antibody | DAKO | Z0334 | |
| B-III tubulin | Antibody | Promega | G7121 |
*To make HEM, mix 1 x 10 L packet of MEM and 160 ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4 °C.
Referências
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393 (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457 (2011).
- Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells. Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
- Scheffler, B. Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9353-9358 (2005).
- Azari, H. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS One. 6, e20941-e20941 (2011).
- Amariglio, N. Donor-Derived Brain Tumor Following Neural Stem Cell Transplantation in an Ataxia Telangiectasia Patient. Plos Medicine. 6, 221-231 (2009).
