Assay Neuroblast: Assay לדור והעשרה של ובתאים העצבית הבחנה בין צאצאיהם גזע עצביים Cell שימוש cytometry זרימה
Summary
זה פרוטוקול וידאו מדגים שיטה חדשה לייצור וטיהור הבאות של ובתאים עצביים ממקורות מתחדשים בתאי גזע עצביים (NSCs) מבוסס על (גרעיניות בגודל פנימי) הפיזי שלהם תכונות ניאון cytometry באמצעות טכנולוגיית הזרימה.
Abstract
בתאי גזע עצביים (NSCs) יכול להיות מבודד והוא התרחבה בקנה מידה גדול, תוך שימוש assay neurosphere הבדיל אל שלושת סוגי התאים העיקריים של מערכת העצבים המרכזית (CNS), כלומר, האסטרוציטים, oligodendrocytes נוירונים. תכונות אלו הופכות את גזע עצביים ו ובתאים מקור רב ערך מתחדשת של תאים במבחנה כגון הקרנת סמים, neurotoxicology ו electrophysiology וכן טיפול בתאי החלפת במחלות נוירולוגיות רבות. בפועל, עם זאת, ההטרוגניות של הצאצאים המל"ל, ייצור נמוך של נוירונים oligodendrocytes, ואת השליטה של האסטרוציטים הבאים בידול להגביל יישומים קליניים שלהם. כאן אנו מתארים מתודולוגיה חדשנית לטיהור הדור הבא של נוירונים בוגרים של הצאצאים המל"ל Murine באמצעות תא הקרינה מיון מופעל (FACS) הטכנולוגיה. באמצעות מתודולוגיה זו, האוכלוסייה העשירה ביותר העצבית תא אבי ניתן להשיג שנינותHout כל astrocyte בולט וזיהום בתום לב המל"ל. ההליך כולל בידול של הצאצאים המל"ל מבודד והרחיב מ E14 יואילו הוד עכבר ganglionic באמצעות assay neurosphere, ואחריו בידוד והעשרה של תאים לא מפותחים על בסיס תכונות פיזיות (גודל ומורכבות פנימית) ו פלורסנט שלהם באמצעות טכנולוגיית הזרימה cytometry. בסך הכל, זה לוקח 5-7 ימים לייצר neurospheres ו 6-8 ימים כדי לבדל את הצאצאים המל"ל ולבודד מטוהרים מאוד תאים עצביים מפותחים.
Protocol
Discussion
היכולת לבודד המוגדרים אוכלוסיות תאים עצביים (כלומר נוירונים, האסטרוציטים ו oligodendrocytes) עשוי לפתור חלק מן המכשולים הקשורים ליישום קליני בתאי גזע עצביים (NSCs). ראשית, הוא מאפשר לנו לאפיין באופן מלא את האוכלוסייה המוצא של התאים התורמות. שנית, היא מאפשרת לנו להשתמש בסוג תא מ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מימון מקרן אוברסטריט.
Materials
| Name of the reagent | Tipo | Company | Catalogue number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
| Anti-PSA-NCAM-PE | Antibody | Miltenyi Biotec | 130-093-274 | |
| PE- Conjugated mouse IgG1 | Isotype control antibody | BD Pharminogen | 556029 | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
| HrBMP-4 | Growth factor | R&D | 314-BP-010 | |
| Poly-L-Ornithine | Reagent | Sigma | P4957 | |
| Fetal Calf Serum | Medium Supplement | Gibco | 10099-141 | |
| GFAP | Antibody | DAKO | Z0334 | |
| B-III tubulin | Antibody | Promega | G7121 |
*To make HEM, mix 1 x 10 L packet of MEM and 160 ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4 °C.
Referências
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393 (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457 (2011).
- Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells. Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
- Scheffler, B. Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9353-9358 (2005).
- Azari, H. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS One. 6, e20941-e20941 (2011).
- Amariglio, N. Donor-Derived Brain Tumor Following Neural Stem Cell Transplantation in an Ataxia Telangiectasia Patient. Plos Medicine. 6, 221-231 (2009).
