神経芽細胞アッセイ：フローサイトメトリーを用いて神経幹細胞の子孫を差別から神経前駆細胞の生成と濃縮のためのアッセイ
Summary
このビデオプロトコルは、神経幹細胞（NSC）の物理的（サイズと内部の細かさ）に基づいて、フローサイトメトリー技術を用いた蛍光特性の再生可能エネルギー源から神経前駆細胞の生成とその後の精製のための新しい方法を示します。
Abstract
すなわち、アストロサイト、オリゴデンドロサイトとニューロン、神経幹細胞（NSCの）神経球アッセイを用いて、中枢神経系（CNS）の三つの主要な細胞型に分化し、大規模で分離し、拡張することができます。これらの特性は、神経幹細胞や前駆細胞などの創薬スクリーニング、神経毒性および電気生理学などのin vitro試験で 、また多くの神経疾患の細胞補充療法のためのセルの貴重な再生可能エネルギー源を作る。しかし、実際には、NSCの子孫の不均一性、ニューロンおよびオリゴデンドロサイトの低生産、分化、その臨床応用を制限するには、次のアストロサイトの優位性。ここでは、蛍光活性化セルソーティング（FACS）技術を使用してマウスNSCの子孫からの未熟な神経細胞の生成とその後の精製のための新規方法論を記述します。この方法を使用して、高度に濃縮された神経前駆細胞集団は、ウィットを達成することができます任意の顕著な星状膠細胞と善意のNSC汚染ホウトベイ。手順は、NSCの子孫を単離し、フローサイトメトリー技術を使用して、その物理的（サイズと内部の複雑さ）と蛍光特性に基づいて、未熟な神経細胞の分離と濃縮に続いて神経球アッセイを使用してE14マウス神経節隆起から、拡大の分化が含まれています。全体的には、NSCの子孫を区別し、非常に未熟な神経細胞を精製単離するための神経と6-8日を生成するために5-7日かかる。
Protocol
Discussion
定義されている神経細胞集団を分離する能力（すなわち、ニューロン、アストロサイトとオリゴデンドロサイト）は、神経幹細胞の臨床応用（NSCの）に関連付けられている障害のいくつかを解決するかもしれません。まず最初に、それは完全にドナー細胞の出発人口を特徴付けるために私達が可能になります。第二に、私たちは病気の性質や段階に応じて、特定の比率で特定の細胞型または?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、オーバストリート財団からの資金によってサポートされていました。
Materials
| Name of the reagent | Tipo | Company | Catalogue number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
| Anti-PSA-NCAM-PE | Antibody | Miltenyi Biotec | 130-093-274 | |
| PE- Conjugated mouse IgG1 | Isotype control antibody | BD Pharminogen | 556029 | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
| HrBMP-4 | Growth factor | R&D | 314-BP-010 | |
| Poly-L-Ornithine | Reagent | Sigma | P4957 | |
| Fetal Calf Serum | Medium Supplement | Gibco | 10099-141 | |
| GFAP | Antibody | DAKO | Z0334 | |
| B-III tubulin | Antibody | Promega | G7121 |
*To make HEM, mix 1 x 10 L packet of MEM and 160 ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4 °C.
Referências
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393 (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457 (2011).
- Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells. Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
- Scheffler, B. Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9353-9358 (2005).
- Azari, H. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS One. 6, e20941-e20941 (2011).
- Amariglio, N. Donor-Derived Brain Tumor Following Neural Stem Cell Transplantation in an Ataxia Telangiectasia Patient. Plos Medicine. 6, 221-231 (2009).
