Neuroblast 분석 : 유동세포계측법을 사용하여 차별화 신경 줄기 세포에서 자손의 연결 전구 세포의 생성과 강화에 대한 분석
Summary
이 비디오 프로토콜 유동세포계측법 기술을 사용하여 물리적 (크기 및 내부 단위) 및 형광 특성을 바탕으로 신경 줄기 세포의 재생 소스 (NSCs)에서의 연결 전구 세포의 생성과 이후의 정화를위한 소설 방법을 보여줍니다.
Abstract
신경 줄기 세포 (NSCs)에 격리하고 확장 가능한 대규모 neurosphere 분석을 사용하고 중추 신경계 (CNS)의 세 가지 주요 세포 유형으로 차별, 즉, astrocytes, oligodendrocytes과 뉴런. 이러한 특성은 신경 줄기 및 전구 세포와 같은 약물 검사, neurotoxicology 및 전기 생리학 등의 체외 연구와 또한 많은 신경 질환에서 세포 대체 요법에 대한 대한 세포의 귀중한 재생 소스를 확인합니다. 그러나 실제로 NSC의 자손, 뉴런과 oligodendrocytes의 낮은 생산, 차별화 자신의 임상 응용 프로그램을 제한하는 다음과 같은 astrocytes의 우위의 이질. 여기서는 형광 활성 세포 정렬 (FACS) 기술을 이용한 murine NSC의 자손에서 미숙 뉴런의 생성 및 그 이후의 정화를위한 소설 방법론을 설명합니다. 이 방법론을 사용하여, 매우 풍부의 연결 전구 세포 인구는 지혜를 얻을 수어떠한 눈에 띄는 astrocyte와 타고난 NSC 오염을 슬프게도 인류. 절차는 NSC의 자손 격리 및 유동세포계측법 기술을 사용하여 물리적 (크기 및 내부 복잡성) 및 형광 특성을 바탕으로 미숙의 연결을 세포의 분리와 농축 다음 neurosphere 분석을 사용하여 E14 마우스 ganglionic eminences에서 확장의 분화를 포함합니다. 전반적으로, 그것은 NSC의 자손을 차별화하는 데 neurospheres 및 6~8일를 생성하는 5~7일 걸리며 매우 미숙의 연결 세포를 정화 분리.
Protocol
Discussion
정의된 신경 세포 인구를 분리하는 기능 (즉, 뉴런, astrocytes와 oligodendrocytes)은 신경 줄기 세포의 임상 응용 (NSCs)와 관련된 방해물의 일부를 해결할 수 있습니다. 첫째, 완전히 기증자 세포의 시작 인구 특성을 우리에게 있습니다. 둘째, 우리가 질병의 특성이나 무대 상황에 따라 특정 비율로 특정 세포 유형 또는 다른 세포 유형의 조합을 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 매우 풍부한 사전 차별화?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 Overstreet 재단에서 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent | Tipo | Company | Catalogue number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
| Anti-PSA-NCAM-PE | Antibody | Miltenyi Biotec | 130-093-274 | |
| PE- Conjugated mouse IgG1 | Isotype control antibody | BD Pharminogen | 556029 | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
| HrBMP-4 | Growth factor | R&D | 314-BP-010 | |
| Poly-L-Ornithine | Reagent | Sigma | P4957 | |
| Fetal Calf Serum | Medium Supplement | Gibco | 10099-141 | |
| GFAP | Antibody | DAKO | Z0334 | |
| B-III tubulin | Antibody | Promega | G7121 |
*To make HEM, mix 1 x 10 L packet of MEM and 160 ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4 °C.
Referências
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393 (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457 (2011).
- Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells. Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
- Scheffler, B. Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9353-9358 (2005).
- Azari, H. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS One. 6, e20941-e20941 (2011).
- Amariglio, N. Donor-Derived Brain Tumor Following Neural Stem Cell Transplantation in an Ataxia Telangiectasia Patient. Plos Medicine. 6, 221-231 (2009).
