Her kan vi demonstrere nyutviklet I • Cryo kit for mus sperm nedfrysing. To-cellers stadiet embryo utvikling med frossen-tint sperm ble forbedret konsekvent i 5 musestammer med bruk av dette settet. Over en 1,5 års periode, var 49 genmodifiserte mus linjer arkivert av sperm nedfrysing med I • Cryo kit og senere hell gjenopprettes ved IVF.
Tusenvis av nye genmodifiserte (GM) stammer av mus har blitt opprettet siden advent av transgenesis og knockout teknologier. Mange av disse verdifulle dyr eksisterer bare som levende dyr, med ingen backup plan i tilfelle nødssituasjon. Nedfrysing av befruktede egg kan gi denne backup, men er kostbare, kan være en lang prosedyre, og generelt krever et stort antall dyr for å lykkes. Siden oppdagelsen av at musen sperm kan være vellykket cryopreserved med en grunnleggende cryoprotective agent (CPA) bestående av 18% raffinose og 3% skummet melk, har sperm nedfrysing blitt en akseptabel og kostnadseffektiv prosedyre for arkivering, distribusjon og gjenvinning av disse verdifulle stammer .
Her kan vi demonstrere en nyutviklet I • Cryo kit for mus sperm nedfrysing. Sperm fra fem brukte stammer av innavlede mus ble frosset bruke dette settet og deretter gjenopprettes. Høyere beskyttelse forholdstall på sperm motilitet (>60%) og rask progressiv motilitet (> 45%) sammenliknet med kontrollgruppen (grunnleggende CPA) ble sett for spermier frosset med dette settet i 5 innavlede mus stammer. To celle stadiet embryo utvikling etter IVF med den gjenopprettede sperm ble forbedret konsekvent i alle 5 musestammer undersøkt. Over en 1,5 års periode, ble 49 GM mus linjer arkivert av sperm nedfrysing med I • Cryo kit og senere gjenfunnet ved IVF.
Siden 1990 har de grunnleggende sperm frysing protokollen med 18% raffinose og 3% skummet melk blitt bevist pålitelig i mange stammer av mus og et stort antall mus linjer har blitt cryopreserved 1,2,3,4,5,6,7. De viktigste årsakene til skade på sædceller under frysing og tining prosessen har vært forbundet med isdannelse 8,9 og reaktive oksygen arter 10. Tilskudd med frie radikaler scavengers, som aminosyrer, og reduksjonsmidler som monothioglycerol, i iskalde medium ble undersøkt og vist seg å øke IVF sats med frossen-tint sperm i innavlede stammer inkludert C57BL / 6 11,6.
I den aktuelle protokollen, utviklet vi en ny I • Cryo kit for mus sperm nedfrysing ved å optimalisere grunnleggende CPA med kommersielt tilgjengelige antioksidanter og is blokkere og ved å endre sperm frysing og IVF prosedyre. Beskyttelse forholdstall på sperm motilitet(> 60%) og rask progressiv motilitet (> 45%) ble sett for sperm fra fem innavlede mus stammer frosset med I • Cryo kit. Det 2-cellers stadiet embryo utvikling sats med frossen-tint sperm i 5 mus innavlede stammer har blitt kraftig forbedret sammenlignet med grunnleggende CPA 11,6.
Ved å bruke kit, oppretter brukeren en konsentrert sperm suspensjon ved frysing sperm fra to hanner for hver linje. Ved å kun frysing 15 sugerør prosessen er rask, enkel og opptar mindre lagringsplass for kort eller lang tids lagring. De fleste ganger, kan mus linjer gjenvinnes ved tining bare 1 eller 2 sugerør.
The authors have nothing to disclose.
Forskningen presenteres her ble støttet av Charles River. Forfatterne er mest takknemlig for genmodifisert Modeller og tjenester gruppen og Embryology personalet for dyr omsorg og hormon injeksjon.
Materials | Supplier | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
CPA | Charles River | Provided with kit | |
STM | Charles River | Provided with kit | |
IVF medium | Charles River | Provided with kit | |
0.25 ml plastic straw | Charles River | Provided with kit | |
Sperm freezing canister | Charles River | Provided with kit | |
Cane and goblet | Charles River | Provided with kit | |
Mineral oil | Sigma | M5310 | Should be embryo tested |
KSOM medium | Millipore | MR-106-D | |
35 mm Petri dish | Falcon | 351008 | |
Heat sealer | ABTEC | TISH-200 | |
4-well multidish | Nunc | 73521-424 | |
Pipettor | Gilson | ||
Pipette tips | Various | ||
37°C + 5% CO2 incubator | Various | ||
LN2 storage system | Various | ||
37°C water bath | VWR | 89032-196 | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
hCG | Intervet | ||
PMSG | EMDChemicals | 367222 | |
1cc syringe w/ 26G 3/8 needle | BD | BD309625 | |
Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5602 | |
30 gauge ½ needle | BD | 305106 | |
Scissors | Roboz | RS-6802 | |
Forceps | Roboz | RS-5135, RS-5110, RS-5005 |