Här kan vi visa den nyutvecklade I • Cryo-kit för mus spermier frysförvaring. Två-cell stadium embryo utveckling med frysta-tinade spermier förbättrades genomgående i 5 musstammar med hjälp av denna sats. Över en 1,5 år, var 49 genförändrad mus linjer arkiveras av spermier frysförvaring med I • Cryo-kit och senare lyckosamt har bärgats med IVF.
Tusentals nya genetiskt modifierade (GM) stammar av möss har skapats sedan tillkomsten av genmodifiering och knockout-teknik. Många av dessa värdefulla djur endast existerar som levande djur, utan backup plan i en nödsituation. Frysförvaring av embryon kan ge den här säkerhetskopian, men är kostsamt, kan vara en långdragen procedur, och i allmänhet kräver ett stort antal djur för framgång. Sedan upptäckten att musen spermier framgångsrikt kan frysförvarade med en grundläggande cryoprotective agent (CPA) som består av 18% raffinos och 3% skummjölk, har spermier frysförvaring blivit en acceptabel och kostnadseffektiv förfarande för arkivering, distribution och återvinning av dessa värdefulla stammar .
Här visar vi en nyutvecklad I • Cryo-kit för mus spermier frysförvaring. Spermier från fem ofta använda stammar av inavlade möss frystes med hjälp av detta kit och sedan återvinnas. Högre skydd förhållandet mellan spermierörlighet (>60%) och snabb progressiv motilitet (> 45%) jämfört med kontrollgruppen (grundläggande CPA) sågs för spermier frysas med detta kit i 5 inavlade musstammar. Två cell stadium embryots utveckling efter IVF med det återvunna spermier förbättrades konsekvent på samtliga fem granskade musstammar. Över en 1,5 år, var 49 GM mus linjer arkiveras av spermier frysförvaring med I • Cryo-kit och senare återvinnas genom IVF.
Sedan 1990 har den grundläggande spermier frysning protokollet använder 18% raffinos och 3% lättmjölk har visat sig vara tillförlitliga i många stammar av möss och ett stort antal av mus-linjer har frysförvarade 1,2,3,4,5,6,7. De viktigaste orsakerna till skador på spermier under frysning och upptining processen har satts i samband med isbildning 8,9 och reaktiva ämnen syre 10. Tillskott av fria radikaler, såsom aminosyror, och reduktionsmedel såsom Monothioglycerol, i det iskalla mediet var undersökt och visat sig kraftigt öka IVF takt med frusna-tinade spermier i inavlade stammar inklusive C57BL / 6 11,6.
I det nuvarande protokollet, utvecklade vi en ny I • Cryo-kit för mus spermier frysförvaring genom att optimera den grundläggande CPA med kommersiellt tillgängliga antioxidanter och blockerare is och genom att ändra spermier frysning och IVF-förfarande. Skydd förhållandet mellan spermierörlighet(> 60%) och snabbt tilltagande motilitet (> 45%) observerades för spermier från fem inavlade musstammar frysta med det jag • Cryo kit. Den 2-cell stadium embryo utvecklingen takt med frusna-tinade spermier i 5 mus inavlade stammar har förbättrats markant jämfört med den som med grundläggande CPA 11,6.
Genom att använda satsen skapar användaren en koncentrerad spermier avstängning genom att frysa spermier från 2 hanar för varje rad. Genom att endast frysning 15 strån processen är snabb, enkel och upptar mindre utrymme för kortare eller långtidsförvaring. De flesta gånger kan musen linjer återvinnas genom upptining bara 1 eller 2 sugrör.
The authors have nothing to disclose.
Den forskning som presenteras här stöds av Charles River. Författarna är mycket tacksam mot genmanipulerade modeller och tjänster grupp och embryologi personal för djurvård och hormon injektion.
Materials | Supplier | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
CPA | Charles River | Provided with kit | |
STM | Charles River | Provided with kit | |
IVF medium | Charles River | Provided with kit | |
0.25 ml plastic straw | Charles River | Provided with kit | |
Sperm freezing canister | Charles River | Provided with kit | |
Cane and goblet | Charles River | Provided with kit | |
Mineral oil | Sigma | M5310 | Should be embryo tested |
KSOM medium | Millipore | MR-106-D | |
35 mm Petri dish | Falcon | 351008 | |
Heat sealer | ABTEC | TISH-200 | |
4-well multidish | Nunc | 73521-424 | |
Pipettor | Gilson | ||
Pipette tips | Various | ||
37°C + 5% CO2 incubator | Various | ||
LN2 storage system | Various | ||
37°C water bath | VWR | 89032-196 | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
hCG | Intervet | ||
PMSG | EMDChemicals | 367222 | |
1cc syringe w/ 26G 3/8 needle | BD | BD309625 | |
Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5602 | |
30 gauge ½ needle | BD | 305106 | |
Scissors | Roboz | RS-6802 | |
Forceps | Roboz | RS-5135, RS-5110, RS-5005 |