الكشف عن الرشاشيات الرئوي الغازية في الخباثة المرضى باستخدام مكونات دم الاطراف تدفق التكنولوجيا

Summary

ويرد بسرعة ودقة نقطة من الرعاية اختبار لداء الرشاشيات الرئوي الغازية. فإنه يستفيد من الاطراف تدفق التكنولوجيا باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التي تربط محددة إلى<em> الرشاشيات</em> مستضد تفرز أثناء الالتهابات الرئوية. الفحص متوافق مع غسل الدم وbrochoalveolar، ويمثل اختبار مساعد رواية لتشخيص المرض.

Abstract

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell transplant recipients¹. Detection of IPA represents a formidable diagnostic challenge and, in the absence of a ‘gold standard’, relies on a combination of clinical data and microbiology and histopathology where feasible. Diagnosis of IPA must conform to the European Organization for Research and Treatment of Cancer and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) consensus defining “proven”, “probable”, and “possible” invasive fungal diseases². Currently, no nucleic acid-based tests have been externally validated for IPA detection and so polymerase chain reaction (PCR) is not included in current EORTC/MSG diagnostic criteria.

Identification of Aspergillus in histological sections is problematic because of similarities in hyphal morphologies with other invasive fungal pathogens³, and proven identification requires isolation of the etiologic agent in pure culture. Culture-based approaches rely on the availability of biopsy samples, but these are not always accessible in sick patients, and do not always yield viable propagules for culture when obtained.

An important feature in the pathogenesis of Aspergillus is angio-invasion, a trait that provides opportunities to track the fungus immunologically using tests that detect characteristic antigenic signatures molecules in serum and bronchoalveolar lavage (BAL) fluids. This has led to the development of the Platelia enzyme immunoassay (GM-EIA) that detects Aspergillus galactomannan and a ‘pan-fungal’ assay (Fungitell test) that detects the conserved fungal cell wall component (1 →3)-β-D-glucan, but not in the mucorales that lack this component in their cell walls^1,4. Issues surrounding the accuracy of these tests^1,4-6 has led to the recent development of next-generation monoclonal antibody (MAb)-based assays that detect surrogate markers of infection^1,5.

Thornton⁵ recently described the generation of an Aspergillus-specific MAb (JF5) using hybridoma technology and its use to develop an immuno-chromatographic lateral-flow device (LFD) for the point-of-care (POC) diagnosis of IPA. A major advantage of the LFD is its ability to detect activity since MAb JF5 binds to an extracellular glycoprotein antigen that is secreted during active growth of the fungus only⁵. This is an important consideration when using fluids such as lung BAL for diagnosing IPA since Aspergillus spores are a common component of inhaled air. The utility of the device in diagnosing IPA has been demonstrated using an animal model of infection, where the LFD displayed improved sensitivity and specificity compared to the Platelia GM and Fungitell (1 → 3)-β-D-glucan assays⁷.

Here, we present a simple LFD procedure to detect Aspergillus antigen in human serum and BAL fluids. Its speed and accuracy provides a novel adjunct point-of-care test for diagnosis of IPA in haematological malignancy patients.

Protocol

1. جمع وتخزين وتحضير سوائل غسل المصل والقصبات جمع عينات الدم من المصل غير المعالجة من خلال السماح على تجلط الدم في 4 درجات مئوية، ومصل الدم المخزن كما aliquots في -20 درجة مئوية قبل الاستخدام. وينبغي أيضا الشعبى سوائل غسيل (بال) يمكن تخزينها كما aliquots عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. ملاحظة: تخزين المصل وBAL aliquots كما يحد من احتمالات تدهور المستضد الهدف بتكرار تجميد ذوبان العينات خلال تكرار التجارب. عينات من ذوبان الجليد وتخلط العينات المصلية وBAL بشكل دقيق من قبل vortexing وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 14000 دورة في الدقيقة. لإجراء الاختبارات الروتينية لعينات من مصل الدم البشري، تمييع 01:01 المصل (V / V) مع متوسط ​​زراعة الأنسجة (TCM). الطب الصيني التقليدي ويتألف من متوسط ​​RPMI-1640، و 10٪ (V / V) الجنين المصل في ربلة الساق، 1٪ (V / V) من حل الجلوتامين L-200MM، وأزيد الصوديوم (0.02٪ W / V) والمواد الحافظة. يتم تحضير المتوسطة في وقت مبكر ويمكن تخزينها في درجة مئوية (4) لعدة أشهر. تطبيق 100 ميكرولتر من مخففإد المصل إلى LFD. لسوائل BAL الإنسان، والسوائل BAL من النماذج الحيوانية، وتطبيق 100 ميكروليتر من عينة أنيق للLFD، مع عدم وجود ما قبل المعالجة. لمصل الدم من النماذج الحيوانية، تمييع الدم 1:2 (V / V) مع الفوسفات مخزنة المالحة التي تحتوي على 4٪ (W / V) EDTA، حرارة ل3min في حمام ماء يغلي، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 14000 دورة في الدقيقة، وتطبيق 100 ميكرولتر من طاف أنيق إلى الجهاز LFD. 2. تطبيق المصل وبال على الجهاز الجانبي للتدفق تخزين الأجهزة الجانبي للتدفق في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية). عند هذه الدرجة، وأجهزة ثابتة لمدة 12 شهرا. إزالة الأجهزة من الحقائب ومكان على سطح مستو. باستخدام طرف ماصة معقمة، وتطبيق 100 ميكروليتر من عينة ما قبل المعالجة BAL المصل أو أنيق الى ميناء الافراج عن الجهاز. السماح للفحص لتشغيل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، في الوقت الذي يجب أن يتم تسجيل نتائج الاختبارات. ملاحظة: في غضون ثوان وسوف يكون السائل حد ذاتهاأون لترحيل من عمل شعري على طول غشاء النيتروسليلوز في إطار المراقبة. 3. تسجيل وتفسير نتائج LFD وLFD يتكون من خط المراقبة الداخلية (المشار إليها بواسطة الحرف C على السكن من البلاستيك)، واختبار الخط (المشار إليها الحرف T). وينبغي أن خط السيطرة تظهر دائما بغض النظر عن الرشاشيات مستضد في عينة مصل أو BAL. هذا يدل على أن الفحص قد تعمل بشكل صحيح. إذا كان المستضد الرشاشيات موجود في عينة مصل أو BAL، فإن خط اختبار تظهر أيضا ضمن 15min من تطبيق نموذج. لأن كثافة من خط اختبار يتناسب مع كمية المستضد الحالي الرشاشيات في العينة، خط الاختبار يمكن أن تبدو وكأنها إيجابي ضعيف (+)، وهو معتدل إيجابي (+ +) أو في شكل إيجابي قوي (+ + +) . ومع ذلك، أي خط اختبار إيجابي، بغض النظر عن شدة ذلك، تشير إلى وجود مستضد الرشاشيات في العينة. في ال(ه) من عدم وجود مستضد الرشاشيات، وسوف لا تظهر اختبار الخط، ويتم تسجيل النتيجة على النحو السالب (-). 4. ممثل النتائج وترد أمثلة ممثل، وضعف سلبي إيجابي، معتدل نتائج إيجابية إيجابية، وقوي LFD مع عينات من مصل الدم وBAL في الشكل 1. وتظهر نتائج الاختبارات إيجابية مستضد LFD (الضعيف والقوي) أو اختبارات LFD السلبية باستخدام سوائل BAL من سرطان الدم النخاعي الحاد (AML) المرضى الذين شخصت وفقا لمعايير التشخيص EORTC / MSG في الجدول رقم 1. المدرجة في هذا الجدول هي المقابلة السريرية وفطرية (galactomannan والثقافة) البيانات، ونتائج اختبار PCR الرشاشيات محددة وضعت في سانت بارثولوميو مستشفى 8، لكل مريض. واستند تشخيص المرض على عوامل المضيف (العدلات، والاستعمال لفترة طويلة من القشرية، والمعاملة مع سائر immunos تي خلية المعترف بهاuppressants)، ومعايير سريرية وجنرال موتورز الإيجابية لBAL (المعرفة هنا كقيمة مؤشر جنرال موتورز> 0.8). في إطار المبادئ التوجيهية EORTC / جي اس 2002 10، 12 مريضا و 13 و 16 تم تشخيص مع الجيش العراقي "ممكن" على أساس العوامل المضيفة والمعايير السريرية الإيجابية أو المعدلة وراثيا. وفقا للمبادئ التوجيهية المنقحة EORTC / MSG (2008) 2، والعوامل الإيجابية المضيفة وجنرال موتورز وحدها أو مضيف العوامل والمعايير السريرية وحدها لا تشير الغازية 'ممكن' العدوى الفطرية ما لم يكن مصحوبا الأدلة الداعمة من البيانات السريرية وعلم الفطريات على التوالي. تم تشخيص حالة المريض 6 مع الجيش العراقي "من المحتمل" في إطار كل من عامي 2002 و 2008 المبادئ التوجيهية بسبب عوامل المضيف، المظاهر السريرية الرئيسية والثانوية والإيجابية المعدلة وراثيا. علما، أنه في حين تم تضمينها في الوقت الراهن ولا في LFD ولا المقايسات PCR في المبادئ التوجيهية EORTC / جي اس، هناك اتفاق قوي بين البلدين وفحوصات اختبار galactomannan التجارية تشير إلى وجود مستضد الرشاشيات والحمض النووي في العينة BAL ق من المرضى 6 و 12. ويمكن الاطلاع على نتائج إضافية من التجارب مما يدل على فعالية فحوصات LFD وPCR في تشخيص IPA في جونسون وآخرون 8. الشكل 1. السلبية (خط السيطرة فقط) والايجابية (خط المراقبة والاختبار) نتائج اختبارات LFD باستخدام المصل وبال. من شدة ردود الفعل اختبار الخط تتناسب مع تركيز المستضد الهدف في عينات مصل الدم وبال. ردود فعل تتراوح عادة من ضعف (+) من خلال معتدل (+ +) لقوي (+ + +). بغض النظر عن كثافة خط الاختبار، وسيكون كل ثلاثة ردود فعل إيجابية المصل تشير الغازية مرض الرشاشيات الرئوي بسبب وجود تعميم الرشاشيات مستضد في مجرى الدم. وردود الفعل الإيجابية BAL (ضعيف، معتدل أو قوي) تشير إلى إنبات الجراثيم وتطوير خيوط المسببة للأمراض يحتمل أن تكون في الرئتين. pdflinebreak "> المريض لا. باتىوالأنف والحنجرة المعلومات السريرية المعايير 1 ثقافة BAL 2 جنرال موتورز EIA مؤشر 3 EORTC / MSG (2002) 4 EORTC / MSG (2008) 5 الرشاشيات PCR نتيجة LFD نتيجة 6 – الرئيسية علامات CT (العقيدات وهالة) وقاصر واحد سلبي 0.9 (إيجابية) محتمل محتمل إيجابي ضعيف الموجب (+) 12 يفترض العدوى الفطرية السابقة لا رئيسيين، أحدهما قاصر المبيضات الجرداء 6.43 (إيجابي قوي) ممكن لا شيء إيجابي إيجابي قوي (+ + +) 13 المخثرة سلبية المكورات العنقوديةylococcus وهاء. بكتيريا في الدم لا الكبرى والصغرى 2 سلبي 0.25 (السلبية) ممكن لا شيء سلبي السالب (-) 16 عدوى الصدر 3 معايير جديدة بما في ذلك التعديلات انصباب الجمع التسلل زائد سلبي 0.16 (السلبية) ممكن لا شيء سلبي السالب (-) 1 العقيدات أو هالات حول فحص التصوير المقطعي هو موح من عدوى فطرية ستعتبر 2 المبيضات الجرداء في السائل BAL كملوث كما هو خميرة الثاني الأكثر شيوعا عزل كجزء من النباتات الإنسان العادي 9 3 فهرس> 0،8 في اختبار تقييم الأثر البيئي من جنرال موتورز BAL يدل على عدوى الرشاشيات 4 واستنادا إلى المعايير EORTC / جي اس 2002 لتشخيص "ممكنه '،' من المحتمل "أو" ثبت "مرض فطري الغازية 10 5 على اساس المعايير المنقحة EORTC / MSG (2008) لتشخيص 'ممكن'، 'من المحتمل "أو" ثبت "مرض فطري الغازية 2 الجدول رقم 1. نتائج اختبارات لعينات LFD BAL من مرضى سرطان الدم النخاعي الحاد مع IPA محتمل من المرضى ومكافحة غسل الأموال والسيطرة (لا يوجد دليل على عدوى)، وEORTC / MSG تشخيص العدوى.

Discussion

يمكن حقا فقط تحديد نهائي لمعهد الإدارة العامة أن يتحقق عن طريق العزل من وكيل خاص بأسباب الأمراض من عينات الخزعة، ولكن الانتعاش من عينات مناسبة غالبا ما يكون غير ممكن في المرضى مريض جدا وغير قابلة للاسترداد الرشاشيات نادرا من الدم. في حين تم إحراز تقدم كبير في مجال استخدام تصوير الشعاعي الطبقي محسوب المسح الضوئي من الصدر في تشخيص IPA، والخصائص التي توحي IPA الرئوية مثل "هالة" أو "الهواء الهلال" علامات عابرة أو يمكن أن تعزى إلى الأعمال الفنية في التنفس أو العدوى الفطرية الأخرى ^11،12. وتستكمل لذلك مثل هذه البيانات مع التقنيات المصلية التي تهدف إلى التعرف على جزيئات توقيع (جنرال موتورز وβ غلوكان) من الفطريات التي تنتشر في مصل المريض أو التي تكون موجودة في سوائل BAL، البلغم أو عينات البول ^13. في حين عرض هذه الاختبارات حساسية مرضية، وأنها تفتقر إلى الدقة الكافية أو تعاني من التدخل في ظل ظروف معينة ^1،6 </sup>.

اختبار للكشف عن LFD IPA المقدمة هنا يمكن تشخيص 'نقطة من الرعاية "للتكنولوجيا معهد الإدارة العامة، ويستغل التي استخدمت حتى الآن في اختبارات للكشف عن الفيروسات والبكتيريا والطفيليات والسموم ^14-19، وأشهرها، لاختبارات الحمل المنزلية لأول مرة من قبل Unipath في عام 1988. في LFD الرشاشيات وصفها هنا، وثبتوا على الرشاشيات محددة ماب JF5 إلى منطقة القبض على (خط اختبار) على غشاء النيتروسليلوز التي يسهل اختراقها. خدم لمكافحة فأر المناعي يجمد على الغشاء في منطقة منفصلة باعتبارها الرقابة الداخلية (خط السيطرة). بالإضافة إلى ذلك على السائل المصل أو BAL الى ميناء الإفراج عنهم، MAB المتقارن الذهب JF5-الغروية في لوحة الافراج بربط المستضد الهدف ومعقدة ثم يمر على طول غشاء يسهل اختراقها من قبل عمل شعري. ماب JF5 ثبتوا في منطقة التقاط بربط مجمع الذهب مستضد JF5-الغروية مما أدى إلى اختبار الخط الأحمر. أي غير منضم JF5-غرواني الذهبالمتقارن بربط الرقابة الداخلية مشيرا الى ان الفحص قد تعمل بشكل صحيح. هذه النتائج في مراقبة خط أحمر.

اختبار سريع، مع 15 دقيقة فقط على القيام بها، هي رخيصة مقارنة مع اختبارات مصل الدم وبال على أساس جنرال موتورز وكشف β غلوكان، ولا تتطلب معدات باهظة الثمن أو مرافق المختبرات واسعة للتشغيل. وعلاوة على ذلك، MAB JF5 لا مع المخدرات أو الملوثات التي ثبت أن يسبب رد فعل إيجابية كاذبة في جنرال موتورز وβ غلوكان الاختبارات ^1،4،6 عبر رد فعل. ميزة إضافية كبيرة خلال التشخيص الحالية هي القدرة LFDs للكشف عن النشاط الذي يدل على نمو الغازية للأنواع الرشاشيات.

والخطوة الحاسمة في إجراء LFD هو الحاجة إلى قراءة نتائج 15 دقيقة بعد تطبيق عينة مصل أو BAL إلى الجهاز. لا ينبغي أن تترك للاختبار لمدة أطول من 15 دقيقة قبل ان يسجل نتائج، وهذه النتيجة قد interpretati التحيزفي. وليس رد فعل ضعيف أن يتعزز من خلال تمديد فترة الحضانة. تم العثور على المعالجة الحرارية للمصل من النماذج الحيوانية من الإصابة لتحسين حساسية الفحص. وجود قيود على اختبار هو أنه من النوعية، وتعتمد على المشغل لإجراء تقييم ذاتي من الإيجابية. كثافة خط اختبار ويختلف وفقا لمحتويات المستضد من عينات المصل وبال (الشكل 1). ومع ذلك، فإن أي رد فعل إيجابي (يحدده مقارنة السلبيات معروفة) يدل على وجود مستضد الرشاشيات، وبالتالي الإصابة. للحد من الذاتية من المقايسات LFD، الأجهزة المحمولة المتاحة التي تسمح الكمي للLFD كثافات اختبار الخط وتمكنها من وضع القيم عتبة الكشف عن مستضد ^20.

التطورات المستقبلية للLFD تشمل التسويق وتطوير LFD متعددة تتيح كشف في وقت واحد من مسببات الأمراض الأخرى الفطرية الغازيةباستخدام MABS محددة للغاية ^3.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Aspergillus LFD	University of Exeter		Available from the corresponding author on request
RPMI-1640	Sigma	R0883
L-Glutamine	Sigma	G7513
Fetal calf serum	Biosera	S9100	Other sources of fetal calf serum can be used in the preparation of TCM
EDTA	Fisher Scientific	BPE120-1